两株耐锰菌的筛选及其生物学性能研究

何园园，薛林贵*，刘映彤

(1. 兰州交通大学 生物与制药工程学院，兰州 730070；2. 甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室，兰州 730000)

铁尾矿中存在多种重金属元素污染，如Fe、Mn、Zn、Cu、Pb等，这些元素超过一定的环境容纳限度[1]，就会危害人体健康和植物生长[2].锰在地球中含量丰富，是一种必需的微量元素[3].但锰过量会引发人体慢性疾病，如典型帕金森综合症[4]，食用锰超标的水和食物可导致生物机体神经毒性、生殖毒性，也可导致肝脏、肺和其他器官损伤[5].对植物体来说，锰过量会诱导植物各种形态变化、导致进行不良的生理和生化反应、造成直接或间接的功能障碍，从而产生各种有害影响[6-7]，如引起植物根部组织缺氧，使植物生长严重受阻等.研究结果表明，释放到环境中的锰等重金属不易被降解和消除[8].因此，防止锰对环境的污染、有效治理锰污染土壤和水体是当前十分紧迫的任务.

目前去除环境中污染锰的方法有锰沙吸附过滤法、氧化法、离子交换法、混凝法等，但此类方法治理大面积污染非常有限，并且耗费时间、人力、财力巨大[9].锰在环境中通常是不能被生物降解的，只能通过多种形态的转换而降低其毒性[10].1998年张杰首次提出锰的生物固定和锰去除理论，指出Mn(II)在中性条件下的氧化是生物氧化[11].许多微生物尤其细菌已被报道能够去除锰(II)，如芽孢杆菌SG-1[12]、恶臭假单胞菌MnB1[13]、Pedomicrobiumsp.ACM 3067[14]、GB-1[15].微生物对污染环境中锰的去除和环境修复具有操作技术简单、速度快、处理成本低、对环境友好不会造成二次污染、对低浓度的锰污染环境处理效果好等优点而备受青睐[16].

在微生物修复锰污染过程中，筛选到性能优良的锰耐受菌是微生物修复锰污染土壤的基础工作[17].本研究通过对张掖市临泽县东小口子铁尾矿采集样本进行分析，其中锰含量超标最严重，质量比达到45 373 mg/kg，超过中国背景土壤值66倍；从铁尾矿分离筛选到能够耐受高浓度Mn2+的土著细菌，优化其培养条件，并研究细菌的除锰能力及其对其他重金属的耐受性，为今后进一步开展锰污染环境的治理提高菌种资源，为铁尾矿污染环境的生态修复提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土壤样本采集

供试土壤样品采自张掖市临泽县东小口子铁尾矿渣堆积废弃地表层5～10 cm的土壤，研究分析结果显示，其中铁尾矿中锰浓度最高达到45 373 mg/kg.装入无菌的灭菌密封袋中，-4 ℃冰箱保存，作为抗性菌株筛选样本.

1.1.2 主要仪器及试剂

主要仪器：实验仪器如表1所列.

表1 实验仪器

主要试剂：实验试剂如表2所列.

表2 实验试剂

1.1.3 培养基

主要培养基：培养基成分如表3所列.

表3 培养基成分

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离纯化

铁尾矿土样过筛取5 g，加入至45 mL浓度为0.9%的无菌生理盐水中，置于摇床震荡1 h，静置后取5 mL上清液，接到500 mg/L Mn2+的液体培养基中，设置温度为30 ℃，转速150 r/min培养48 h；取0.1 mL菌液梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌悬液，取浓度为10-4、10-5、10-6倍的菌悬液0.025 mL分别涂布在500 mg /L Mn2+的固体培养基上，置于30 ℃培养箱中培养；取生长状况良好的菌株，转接到1 000 mg/L Mn2+的新鲜液体培养基中，30 ℃培养48 h.

1.2.2 优良菌株的筛选与驯化

根据崔馨文[18]的方法，将上述分离纯化获得的菌株转接到1 000 mg/L Mn2+的液体培养基中，在恒温30 ℃，转速为150 r/min条件下培养48 h，淘汰未生长的菌株,选取长势较好的菌继续转接到1 500 mg/L Mn2+的液体培养基中，依次逐步提高锰离子浓度为2 000 mg/L、2 500 mg/L、3 000 mg/L、3 500 mg/L、4 000 mg/L进行筛选、淘汰与驯化.在4 000 mg/L Mn2+液体培养基中培养驯化后,于相应的固体培养基上挑选长势较好，且菌落形态不一样的一批菌株，在LB固体培养基中进行分离纯化，对分离出来的菌株进行编号，并用甘油冻冻存于-80 ℃冰箱.

1.2.3 菌株的鉴定

菌株在LB固体培养基上划线培养，观察菌落的形态特征，对菌体进行革兰氏染色试验.采用通用引物27 F和1492 R进行PCR扩增，将PCR产物序列由上海生工公司进行测序；通过NCBI进行序列相似性比对，并用MEGA 5.0构建系统发育树，分析菌株与物种的亲缘相似性.

1.2.4 菌株培养条件研究

以接种量1%、pH=7、30 ℃、150 r/min恒温摇床、LB培养基培养为基础条件，研究不同温度、不同pH、不同接种量对菌株生长的影响.

温度：将温度梯度分别设置为25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，设置三组平行，其他均为基础条件，分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取样，测定OD600的值，绘制生长曲线.

pH：将pH梯度分别设置为4、5、6、7、8，设置三组平行，其他均为基础条件，分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取样，测定OD600的值，绘制生长曲线.

接种量：将接种量梯度分别设置为1%、2%、3%、4%，设置三组平行，其他均为基础条件，分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、54 h和60 h取样，测定OD600的值，绘制生长曲线.

1.2.5 不同浓度Mn2+对菌株生长的影响

菌株在固体LB培养基活化，培养至长出菌落后，挑选单菌落至液体LB培养基中，在30 ℃、150 r/min恒温摇床培养至OD600约0.8.菌株以1%的接种量分别接入添加不同浓度Mn2+(1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L、7 000 mg/L、9 000 mg/L)的LB液体培养基中，每个浓度各3个重复，各组均设置30 ℃、150 r/min恒温摇床震荡培养至60 h，以空白液体培养基为对照，用OD600的数值表征培养液中的菌体浓度.

1.2.6 菌株在最适培养条件下对不同浓度锰的去除效果研究

将菌株培养至OD600为0.8左右，分别接入含Mn2+浓度为1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L的液体LB培养基中.根据上述最适培养条件培养，分别在24 h、48 h、72 h后取样，8 000 r/min离心5 min取上清液，测定上清液Mn2+的浓度.

采用ICP-MS测定，采用公式(1)计算重金属去除率

(1)

其中：η为去除率;Co表示处理前溶液中重金属浓度;Ce表示处理后溶液中重金属浓度.

1.2.7 不同重金属离子对菌株生长的影响

菌种的活化和种子液的制备同1.2.6.菌株以1%的接种量，分别接种于含Mn2+浓度为100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L、1 100 mg/L、1 300 mg/L、1 500 mg/L不同重金属离子的液体LB培养基中，设置温度为30 ℃、转速为150 r/min，各三组平行，于24 h取样，测定OD600的值，绘制生长曲线，以此表征菌株在不同浓度的重金属离子下菌体的生长状况.

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

通过分离纯化从张掖市临泽县宏鑫铁尾矿筛选到两株耐锰的细菌，编号HF-1、HZ-1.

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征

当培养温度为30 ℃，在LB培养基上培养24 h，进行革兰氏染色，耐锰菌株HF-1、HZ-1的菌落形态如图1所示，HF-1菌落呈椭圆形，灰色，表面光滑湿润；HZ-1菌落形状呈圆形，表面粗糙，扁平，边缘不规则.经革兰氏染色结果显示，菌株HF-1为革兰氏阴性菌，HZ-1为革兰氏阳性菌.

2.2.2 16S rRNA 基因序列分析

利用NCBI中的BLAST工具，将测序得到的两株细菌的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中相似性较高的菌株进行同源性比对，用MEGA 5.0构建系统发育树，结果如图2所示.HF-1与Enterobacterasburiaestrain BSP4(KF 360066.1)亲缘关系最接近，置信度为100%，HZ-1则与Bacilluspumilusstrain 13(MH 910117.1)亲缘关系最接近，置信度为100%.因此，HF-1菌株被鉴定为Enterobacterasburiae，HZ-1菌株被鉴定为Bacilluspumilus.

图1 菌株HF-1、HZ-1的菌落形态及其革兰氏染色结果Fig.1 Colony morphology and gram staining results of HF-1 and HZ-1 strains

图2 菌株HF-1、HZ-1基于16s rRNA序列同源性的系统发育树图Fig.2 Phylogenetic tree map of HF-1、HZ-1 strains based on 16s rRNA sequence

2.3 菌株培养条件

2.3.1 不同温度对菌株HF-1、HZ-1生长的影响

温度是影响微生物生长的一个重要因子.不同温度对菌株HF-1、HZ-1生长的影响见图3，HF-1、HZ-1随着培养时间的延长，其OD600逐渐升高再降低.当HF-1培养温度在35 ℃、48 h后其生长量达到最高，即OD600为6.33，HF-1在低于35 ℃时，菌株生长状况基本良好，当温度为40 ℃时，HF-1的生长受到明显的抑制；HZ-1培养温度在30 ℃、36 h后其生长量达到最高，即OD600为7.71；HZ-1的温度低于30 ℃时，菌株生长随着时间的延长，OD600越高,并且其OD600最高均达到6；当温度高于30 ℃时，菌株生长出现下降，当温度为40 ℃时，菌株生长受到明显抑制.因此两株菌的最适温度均在中温，温度过高或过低均会抑制菌株生长.这是由于温度的改变会影响生物体内所进行的许多生化反应，因而影响生物的代谢活动；在一定温度范围内，生化反应速率随温度上升而加快，超过一定限度，细胞功能就会下降以致死亡；综上，不同温度对菌株HF-1生长的影响：35 ℃>30 ℃>25 ℃>20 ℃>40 ℃；不同温度对菌株HZ-1生长的影响：30 ℃>25 ℃>30 ℃>20 ℃>40 ℃.

图3 温度对菌株HF-1、HZ-1生长的影响Fig.3 Effects of temperature on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.3.2 不同pH对菌株HF-1、HZ-1生长的影响

微生物的生命活动、物质代谢与pH值有密切关系，不同pH对菌株HF-1、HZ-1生长的影响见图4，HZ-1、HF-1随着pH的增加、培养时间的延长，菌株的OD600均先增大而后逐渐减小；当pH为7时，HF-1、HZ-1的OD600达到最高，分别为5.33和7.71；pH为4时，HZ-1不生长，而HF-1最高OD600达到4.05，故酸性条件下，HF-1比HZ-1的生长更具有优势.可以看出，当pH大于5时，HZ-1、HF-1的生长状况良好，且HZ-1较HF-1生长状况较好.

图4 pH对菌株HF-1、HZ-1生长的影响Fig.4 Effects of pH on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.3.3 不同接种量对菌株HF-1、HZ-1生长的影响

不同接种量对菌株HF-1、HZ-1生长的影响见图5，由图5可见，接种量对菌株的生物量影响不大.但相比之下，接种量为1%时，菌株的生长最好.菌株HF-1、HZ-1在接种量为1%时，OD600达到最高，分别在36 h时OD600值为5.33、6.91；接种量分别在2%、3%、4%时，OD600值反而降低，可能由于菌体生长过快，使得培养基粘度增加，造成溶氧不足，抑制菌体生长；故菌株HF-1、HZ-1的最适接种量均为1%.

图5 接种量对菌株HF-1、HZ-1生长的影响Fig.5 Effects of inoculation amount on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.4 不同浓度Mn2+对菌株HF-1、HZ-1生长的影响

为了分析不同浓度Mn2+对菌株HF-1、HZ-1生长的影响(见图6)，从图6中可以看出，菌株HF-1随着Mn2+浓度增高，OD600在36 h内逐渐增高，54 h后逐渐降低；菌株HZ-1随着Mn2+浓度增高、时间的增加，OD600逐渐升高；当Mn2+浓度为1 000 mg/L时，菌株HF-1、HZ-1的OD600达到最高值，分别是5.74、7.56.而两株菌均能在Mn2+浓度为9 000 mg/L生长，即菌株HF-1、HZ-1对Mn2+的耐受浓度可达9 000 mg/L.

图6 不同浓度Mn2+对菌株HF-1、HZ-1生长的影响Fig.6 Effects of Mn2+ on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

2.5 菌株在最适条件下对不同浓度锰的去除效果研究

菌株对不同浓度Mn2+(1 000 mg/L、3 000 mg/L、5 000 mg/L)去除效果如图7所示，随培养时间的增加，菌株锰(Ⅱ)去除能力也逐渐增加；当Mn2+浓度为1 000 mg/L，菌株HF-1在24 h时锰(Ⅱ)去除率为72.34%，随着时间的延长，到72 h时，其锰去除率达到94%；菌株HZ-1在24 h时锰(Ⅱ)去除率为71.34%，72 h时锰(Ⅱ)去除率达到97%；随后，菌株随着Mn2+离子浓度增加，其去除率逐渐减少；当在48 h时，菌株HF-1在Mn2+1 000 mg/L的锰去除率为85.67%，而在Mn2+5 000 mg/L的锰去除率为54.96%，菌株HZ-1在Mn2+1 000 mg/L锰去除率为88.67%，在Mn2+5 000 mg/L的锰去除率为67.83%.

图7 菌株HF-1、HZ-1对Mn2+的去除效果Fig.7 Mn2+ removal effect of HF-1 and HZ-1 strains

2.6 不同重金属离子对菌株HF-1、HZ-1生长的影响

菌株分别接种于添加有100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L、1 100 mg/L、1 300 mg/L、 1 500 mg/L不同金属离子的液体LB培养基中，培养24 h后如图8所示，当Cd2+浓度为300 mg/L时，菌株HF-1OD600值为0.84，随着Cd2+浓度增加，其OD600逐渐降低，当Cd2+浓度为700 mg/L时，HF-1不生长；当As3+浓度为300 mg/L时，菌株HF-1OD600值为1.52，当As3+浓度为700 mg/L时，HF-1缓慢生长，OD600值为0.8，当As3+浓度为900 mg/L时，HF-1不生长；当Cu2+浓度为900 mg/L时，菌株HF-1生长状况良好，其OD600值为1.02；菌株HF-1对Pb2+耐受较好，当Pb2+浓度为1 500 mg/L时，OD600值为3.21；当Cd2+浓度为300 mg/L时，菌株HZ-1OD600值为1.23，当 Cd2+浓度为900 mg/L时，HZ-1不生长；当As3+、Zn2+浓度为300 mg/L时，菌株HZ-1OD600值分别为1.62、1.73，当As3+、Zn2+浓度为900 mg/L时，菌株HZ-1不在生长；当Cu2+浓度为700 mg/L时，菌株HZ-1OD600值为2.69，随着Cu2+浓度增加，其OD600值逐渐降低；当Pb2+浓度为1 200 mg/L后，菌株HZ-1OD600值逐渐降低至不生长.故菌株HF-1能够耐700 mg/L As3+、1 500 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+,菌株HZ-1能够耐500 mg/L As3+、1200 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+.

图8 不同浓度的重金属对菌株HF-1、HZ-1生长的影响Fig.8 Effects of different concentrations of heavy metals on the growth of HF-1 and HZ-1 strains

3 讨论

本研究从铁尾矿土壤分离筛选出两株高耐锰菌，其中两株菌对锰的耐受浓度可达9 000 mg/L.田美娟等[19]从太平洋海底泥样品中富集、筛选到50株锰抗性菌株，其中短小芽孢杆菌(B.pumilus)M12对Mn2+的耐受能力最好，最高Mn2+耐受浓度为130 mmol/L.黄慧敏[20]从湖南湘潭锰矿区的矿渣中分离出的三株耐Mn2+菌株，其中Ralstoniapickettistrain HM8对Mn2+的耐受能力最好，最高Mn2+耐受浓度为10 000 mg/L；田群等[21]从松桃的锰冶炼区寨英镇采集的土样中分离得到7株耐锰能力达到1 800 mg/L的细菌，其中S7和S16两株菌对锰的耐受能力高达2 200 mg/L.此外，本研究对其他重金属也具有较高的耐受性.目前关于铅、镉、铜、砷、锌等重金属离子耐受性细菌已经报道的许多，李同灵等[22]从重金属污染土壤中分离得到了一株大肠杆菌(Escherichia)P15，最高可耐受1 200 mg/L Pb2+；Sodbaatar等[23]从蒙古国Zaamar金矿土壤中筛选到6株重金属耐受菌株，其中菌株Z1对Pb2+、Cu2+、Zn2+耐受性最好，分别能够耐受8 mmol·L-1Pb2+、8 mmol·L-1Zn2+、2 mmol·L-1Cu2+；康薇等[24]从湖北大冶铜绿山铜铁矿废弃露采场污染土壤中分离得到一株芽孢杆菌属(Bacillussp.)TLSB2-K，最高铜耐受浓度为700 mg/L；Shakya等[25]从尼泊尔的Terai分离出的9株耐Mn2+菌株，其中对As3+的耐受性分别为1 000 mg/L和749 mg/L以上.而本研究的两株菌可单独耐受1 200 mg/L Pb2+、800 mg/L Cu2+、100 mg/L Cd2+、500 mg/L As3+、600 mg/L Zn2+，在重金属污染土壤修复中具有潜在的应用价值.

从张掖市临泽县东小口子铁尾矿筛选得到的两株菌株在Mn2+浓度为1 000 mg/L时，锰去除率最高分别达到97%和94%，这两株菌均能够去除培养液中的锰，一方面是由于锰是菌株代谢相关酶类的辅助因子，细菌吸收锰用于自身代谢；另一方面菌株将溶液中低价态的锰转化成高价态的锰氧化物或复合物，或者通过细菌表面的吸附作用、胞内积累作用来减轻高浓度锰对于菌体的毒害，从而降低低价态锰的浓度和毒性.崔罄文[18]筛选到的锰氧化菌株能够高效地催化Mn(II)转化成Mn(IV)，使可溶性 Mn(II)形成沉淀，因而可以去除水体中的锰.Zhang等[26]筛选到嗜水气单胞菌DS02对可溶性Mn(II)的去除率达到近90.0%(495 mg·L-1)，经过拟合XPS数据表明，82.0%的Mn(IV)是锰氧化物的主要成分；而菌株对Mn(II)的吸附在很大程度上被证明是一种协同效应，Ding等[27]从重金属污染土壤筛选到耐锰菌株LLDRA6在水溶液中表现出了较高的Mn(II)生物吸附能力，并利用FT-IR红外光谱分析表面细胞壁参与吸附的官能团有O-H、N-H、C-H、C-N、O-C-O、C-O；目前，发现耐锰的微生物种类繁多，各种微生物对于锰的去除能力各异.田美娟等[19]筛选到一株食烷菌属M59在28 ℃、pH=7的条件下,对Mn2+浓度为30 mmol/L的去除率达到99%，而在相关锰(Ⅱ)去除菌报道中，最高的锰去除菌也要培养40 h以上才可以达到锰去除率在95%以上[28-29]；姚远等[30]在选择培养基中筛选到的两株菌株，在含Mn2+浓度为65 mg/L的液体培养基中，对Mn2+的去除率达到85%以上；彭小伟等[14]通过从电解金属锰废渣中筛选出一株耐锰性强的霉菌A5，在28 ℃，接种量为2%，摇瓶转速150 r/min，200 mg/L Mn2+条件下培养47 h，A5霉菌对锰的去除率达到97.1%.本研究得到的两株耐锰菌均能去除环境中高浓度锰，对于重金属污染土壤的生物修复提供了微生物菌种资源.

4 结论

本研究从张掖市临泽县东小口子铁尾矿采集土壤的样品中，分离筛选得到两株耐锰性较高的菌株HF-1、HZ-1，它们分别能耐受Mn2+浓度9 000 mg/L；通过16S rRNA序列分析，鉴定为阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus).两株菌的培养条件和重金属耐受性的研究表明：

1) HZ-1的最适生长条件为30 ℃、pH 7、接种量为1%；HF-1的最适生长条件：35 ℃、pH 7、接种量1%；

2) 菌株HZ-1锰去除率最高达到97%，HF-1锰去除率最高达到94%.两株菌均可以去除环境中含量较高的锰；

3) 根据重金属耐受性实验显示，菌株可单独在500 mg/L As3+、1 200 mg/L Pb2+、600 mg/L Zn2+、100 mg/L Cd2+、800 mg/L Cu2+的环境中生长，在微生物修复其他重金属离子污染土壤的修复中有较好的应用前景.