西北农村窖水水质与生物降解作用分析

张莉红，陈新娟，李 杰*,3，王亚娥，杨 超，张可轩，张雨薇，曾可欣

(1. 兰州交通大学 环境与市政工程学院，兰州 730070；2. 甘肃省膜科学技术研究院有限公司，兰州 730020；3. 甘肃省非常规水资源化利用技术重点实验室，兰州 730020)

在现有供水系统无法满足需求的一些西北黄土干旱半干旱地区，广泛开展的雨水收集不仅有效地缓解了水资源短缺，最大限度地减少了水土流失和洪涝灾害，而且为农业发展提供了可能性[1-3].通过使用不同的集雨面，如砂浆屋顶和水泥铺成的庭院，夯实的土地或道路表面，可有效地收集雨水并储存在不同材质水窖中[2-5].

窖水水质因子众多，且受气候[1]、周围环境[2]的影响.大量研究表明[2-4]，雨水在集流过程中受到大气、集流面以及入窖过程中窖壁或底泥的污染，长期饮用会引发肠道疾病.西北山谷众多，大气污染物的扩散特性有限，不会造成致病性的污染[5].赵文君等[6]对水泥、固化土和橡塑水窖中浊度、pH值、COD等水质指标进行了对比研究，发现不同材质的水窖对雨水水质的影响各有优劣，如水泥砂浆水窖浊度较优但pH值偏高，而橡塑水窖pH值较优但COD值偏高，固化土水窖除浊度高外其余指标均较好.Amin等发现从屋顶收集的雨水比从露台集水区收集的雨水的细菌学质量更高.与庭院收集的雨水相比，公路收集的雨水质量较差[7].这些结果表明，集雨面的不同对窖水质量有较大的影响，各水质参数在时间上存在显著差异，例如细菌学参数一般会随着储存时间的延长而得到改善.对不同时期窖水水质的研究大多集中在对丰水期和枯水期的水质差异性的研究.窖水质量在夏季之后趋于改善，冬季窖水质量最高，这种趋势在总大肠菌群中最为明显[8].但不同集雨面不同时间窖水水质的污染特征研究较少，尤其是人为活动较频繁的地方和牲畜养殖场所等.已有研究表明[8]，储存时间对窖水水质的改善起着至关重要的作用.储存过程中窖水由于自净作用(特别是生物降解作用)使水中各污染物都有不同程度的降解[9-10].目前对于不同集雨面窖水的生物降解作用也尚不明确.

本文研究了三种不同集雨面水窖中一年的窖水常规参数及细菌学参数变化，着重探讨了不同集雨面在不同时间对窖水水质的影响.并且采用广泛应用于地表水和城市饮用水水质评价的综合指数评价法[11-12]进行了综合评价.通过高通量测序技术分析了不同集雨面窖水的生物降解作用.本研究结果将为西北黄土及其他干旱半干旱地区集雨工程在集雨面形式以及改善窖水卫生质量方面提供了进一步的科学依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集

从2018年12月到2019年11月连续一年采集水样，对象为甘肃省定西市某农村农户不同集雨面的三口水泥材质水窖.具体特征参见表1.微生物样品进行现场取样，取700 mL的水样经0.22 μm聚碳酸酯膜负压过滤，收集滤膜，用事先灭菌且经过75%的酒精消毒的医用剪刀剪碎后，置于2 mL的无菌离心管中，于-80 ℃的超低温冰箱中保存至DNA提取.

表1 甘肃省定西市某农村水窖

1.2 检测分析

定期检测窖水浊度、pH、CODMn等常规污染指标和细菌总数、总大肠菌群等细菌学指标，各类指标检测均出自国家城市供水水质监测网兰州监测站.根据《生活饮用水卫生标准》(GB/T 5750-2006)考察了一年内窖水的水质情况.

1.3 水质评价

1.3.1 水质分指数

根据评价标准计算各项指标的水质指数，公式为Ii=Ci/Si，其中：Ci为指标检测浓度实测值的平均值；Si为国家标准值[11-12].

1.3.2 水质类指数

1.3.3 水质综合指数

表2 水质综合评价各类指标权重

表3 评价级别的划分及其意义[13]

1.4 高通量测序分析

首先提取总DNA，同时采用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量.PCR扩增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增，正向引物为F∶ACTCCTACGGGAGGCAGCA，反向引物为R∶GGACTACHVGGGTWTCTAAT，同时设置阴性对照.PCR反应条件为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；27个循环；72 ℃后保温5 min，于4 ℃保存.对PCR扩增产物回收后进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek,FLx800).根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合.采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库.然后上机进行测序(上海派森诺生物科技有限公司).

2 结果与讨论

2.1 常规参数分析

常规水质参数浊度、pH值和CODMn都会根据集流过程中周围环境而有显著差异.集雨面对这类常规水质参数有较大影响，尤其是浊度.CODMn对集雨面的类型也较敏感.如图1所示，全年3个水窖中浊度均超过《生活饮用水卫生标准》(GB/T 5750-2006).但窖水浊度差异较大，依次为1#>3#>2#，集雨面环境卫生较好的2#水窖浊度较低，且全年变化不大，而集雨面环境卫生较差的1#水窖浊度最高且变化较大，说明窖水浊度受集雨面的影响较大，这与已有研究相似[1,9]，人工清扫集雨面污染物去除率可达70%[14].1#、3#水窖水全年中只有6、7、8月份浊度较高，因为西北地区降雨分配不均，6～8月份是雨季，窖水浊度受雨季降雨所影响，武福平等[9]研究了8月份暴雨过后窖水水质，发现初期雨水浊度较大，随着沉降作用逐渐降低直至稳定.

CODMn也呈现出和浊度一致的趋势.发现同一时间段浊度较高的水窖CODMn也较大.全年整体CODMn依次为1#>3#>2#，1#全年CODMn超过《生活饮用水卫生标准》(GB/T 5750-2006).3#有5个月超标，分别是6月、8月至11月.2#只有2个月超标，分别为2月和9月.CODMn一定程度上与周围环境息息相关，说明相比2#、3#水窖，1#水窖因人为活动频繁而周围较不洁净，入窖过程中集雨面土面离子的释放和水流的挟带作用导致CODMn的增加[15].2#，3#窖CODMn在9月突增，是因为2#、3#窖水的pH较低所致(见图1)，张建锋等[15]研究了西北农村水窖集雨场表面土壤离子释放特征发现，pH越低，集雨面土壤离子释放容量越大.

图1 不同时间段浊度、CODMn、pH变化Fig.1 Turbidity,CODMn,and pH changes in different time periods

pH值基本在7.7±0.23～8.7±0.51之间，整体呈偏碱性范围，pH值基本符合《生活饮用水卫生标准》(GB/T 5750-2006)，这与已有研究类似[2,16].pH<4和pH>11的饮用水会对健康产生有害影响.张国珍等[15]研究了黄土塬地区村镇集蓄雨水水质，发现pH偏碱性，随降雨历时的变化不是很明显.需要说明的是，1#水窖前5个月pH较高是因为水窖采用水泥修补所致，硅酸盐水泥材质在水化和水解过程析出了碳酸钙等碱性物质所致[17].此外，pH升高也可能是由于有机碎屑、粘土和矿物颗粒所致[2].

2.2 细菌学参数分析

目前，窖水质量的常见健康问题与细菌有关，尤其是总大肠杆菌.为了确定窖水中可能存在的致病微生物，最广泛使用的指标也是总大肠菌群.张晓华等[18]调查了甘肃农村7个不同乡镇的窖水中细菌总数和大肠菌群，发现细菌总数均超标严重，大肠菌群只有少数乡镇窖水以个位数检出，不同时间段大肠杆菌的变化如图2所示，从图2可以看出，本研究总大肠菌群在8～10月超标严重，受集雨面影响较小.菌落总数在人为活动密集的集雨面有个别月份含量较高.这一结果与张晓华等研究结果不一致.2#，3#菌落总数数据较为稳定；1#窖水菌落总数整体较高，并且变幅较大.其原因可能是1#位于门口，集流面由于人为活动造成的污染源相对较多.总大肠杆菌群是反映粪便污染的重要指标，3个水窖的总大肠杆菌群均得检出，3个窖水在前7个月中数据较为稳定，可能是由于这几个月无进水，储存时间对细菌学参数的质量有所改善，Amin等[2]表明大约1周的存储时间后，细菌学参数浓度降低了70%至90%.1#、3#窖水总大肠菌群整体较高，尤其是9月和10月.可能原因是集流场所时常有家畜出现，厕所和马厩等大多建在离集流场所和房屋很近的地方，没有及时清理周边家禽粪便.2#窖8月和10月总大肠菌群主要是由于树叶和树叶上鸟粪等广泛分布的结果.灰尘杂质携带促进微生物生长的促进剂[19].总之，总大肠杆菌群与菌落总数与环境和卫生条件有关，建议定期清理集雨面，尤其是人类活动和禽畜活动频繁地带，以保证窖水质量.

图2 不同时间段菌落总数和总大肠菌群变化Fig.2 Changes in the total number of colonies and total coliforms in different time periods

2.3 水质评价结果

窖水水质列于表4.综合评价根据表4可得：2#水窖I总为第2等级，水质较好，基本满足生活饮用水标准；1#和3#水窖I总为第3等级，也可以满足灌溉用水和畜牧用水.从水质综合指数评价结果来看，水质指数依次为1#>3#>2#，与实测结果相似，说明采用该水质综合评价方法对窖水水质评价结果可靠，能反映窖水水质的实际情况.

表4 窖水水质指数

从类指数来看，1#窖水和3#窖水水质的感官指标分别为重度污染和中度污染，1#窖水、2#窖水和3#窖水细菌学指标的分指数均属于重污染范围，可以得出：细菌污染是影响定西市农村窖水水质卫生的根源，细菌污染状况不容忽视[2].

进一步从作为饮用水的2#窖水细菌学指标的分指数看，细菌总数的分指数为3.36，总大肠菌群的分指数为2，总大肠菌群是评定水被粪便污染的重要指示菌，显示窖水中细菌的污染主要来源.1#窖水和3#窖水同样存在此污染情况.

2.4 生物降解作用分析

2.4.1 微生物多样性分析

三口水窖的多样性指数如图3所示.D4、D5、D6分别代表1#、2#、3#水窖的微生物.Chao1指数和Observedspecies指数越大，表明群落的丰富度越高.Shannon指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度.Simpson指数值越高，表明群落的多样性越高.可以看出，1#水窖的丰富度最高，2#水窖次之，3#水窖的丰富度最低.而多样性高低顺序为2#>3#>1#.从Shannon指数的变化来看，与3#水窖相比，1#和2#水窖微生物群落的丰富度和均匀性都较高.同时可以看出，四种指标的p>0.05，说明各样品之间不具有显著性差异，样品可能来源相同，这与三口窖同属于水泥窖相对应.

图3 微生物群落丰富度和多样性分析Fig.3 Analysis of the abundance and diversity of microbial communities

2.4.2 微生物群落结构分析

三口水窖在门水平上的微生物群落如图4所示.可以看出，三口水窖在门水平上的主要菌门有8种，分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)，构成了门水平上水泥窖水的基本群落结构.其中丰度最大的菌为变形菌门，丰度分别为65.7%、55.1%、45%.变形菌门主导了系统的生物净化过程[20-21].其次为放线菌门和拟杆菌门，在1#水窖中丰度分别为22.3%和9.1%，在2#水窖中丰度分别为23.5%和13.2%，在3#水窖中丰度分别为20.9%和30.1%.放线菌门对水中有机碳具有分解作用[22-23]，拟杆菌门具有有机物降解的功能[24-25]，可以看出，不同集雨面窖水中微生物群落结构具有明显的差异.结合2.1节，3#水窖中较高的有机物含量富集了大量拟杆菌门.结果表明不同集雨面显著影响了微生物群落结构.

图4 门水平上微生物群落结构分析Fig.4 Analysis of microbial community structure at the phylum level

为了进一步分析窖水中的功能菌的变化情况，本文对相对丰度前20的属水平上的细菌做了微生物层次聚类分析，如图5所示.从分类树图可以看出，本次取样较为合理，同组之间均匀度较高.从柱状图可以看出属水平与污染物降解有关的菌主要有沼泽菌(Limnohabitans)、黄杆菌属(Flavobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、鞘氨醇杆菌(Sphingorhabdus)、鱼孢菌(Sporichthyaceae)、景天胺杆菌(Sediminibacterium)、甲基化菌(Methylotenera)、假单胞菌(Pseudomonas).在1#水窖中丰度分别为19.8%、1.03%、1.01%、1.97%、4.1%、1.87%、1.96%、0.46%，在2#水窖中丰度分别为4.04%、1.95%、0.27%、5.98%、2.25%、4.49%、1.77%、0.20%，在3#水窖中丰度分别为7.5%、11.7%、2.56%、4.03%、3.05%、1.6%、0.26%、1.94%.沼泽菌和鱼孢菌与溶解性有机物的降解有关，能够消耗低分子量碳[26].景天胺杆菌为好氧菌，在硝酸盐去除[27]、有机物降解[28]以及氯化物去除[27]方面意义重大.不动杆菌不仅有助于难降解污染物的降解[28]，而且在硝酸盐的去除中也起着重要作用[29].黄杆菌属于拟杆菌门，为好氧菌，能够降解淀粉、纤维素、脂肪等复杂有机物，同时合成新的微生物体[30-31].甲基化菌为窖水中的关键微生物菌属，参与窖水中污染物的降解[32].鞘氨醇杆菌在多环芳烃的降解中具有重要作用[33].结合水质分析，进一步说明了低丰度菌，如鞘氨醇杆菌和景天胺杆菌，也对微生物群落有着显著贡献[32].

图5 属水平上微生物群落结构分析Fig.5 Analysis of microbial community structure at the genus level

3 结论

1) 全年3个水窖中浊度、总大肠菌群和菌落总数均超过《生活饮用水卫生标准》(GB/T 5750-2006)；浊度普遍超出10倍以上；细菌总数和总大肠杆菌群分别超出40倍和30倍以上；CODMn只有1#水窖全年超标，而2#、3#水窖只有个别月份超标；pH值基本在7.7±0.23～8.7±0.51之间；窖水水质污染因子年内变化较大，每年3月或4月污染指数开始增大，到7月或9月达到最大值之后逐渐降低；窖水水质指标浊度、pH、CODMn等常规参数和总大肠菌群、菌落总数等细菌学参数均受集雨面影响较大.

2) 水质综合评价方法对该水泥窖水水质评价结果与实测结果一致；不同集雨面受污染程度依次为：1#水窖>3#水窖>2#水窖.

3) 水泥窖水中与污染物降解有关的菌主要有沼泽菌、黄杆菌属、不动杆菌属、鞘氨醇杆菌、鱼孢菌、景天胺杆菌、甲基化菌、假单胞菌；不同集雨面窖水中菌的丰度不同，鞘氨醇杆菌和景天胺杆菌对微生物群落有着显著贡献.