不同形貌纳米氢氧化镁对芒果叶斑病原真菌的抑制作用

张顶洋， 邱赛飞， 饶文华， 郭雪萍， 曹芳， 翟天鋆， 关雄， 潘晓鸿

（福建农林大学植物保护学院，闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002）

芒果（Mangifera indica Linn）不仅风味独特，而且营养价值较高，是我国重要的热带种植水果之一[1]。真菌病害是芒果生产中极为重要的限制条件[2]，已报道的芒果真菌病害多达80多种[3]，其中最常见的为芒果炭疽病、白粉病、叶斑病、流胶病等[4]，又以芒果叶斑病发生较普遍、危害性较大，且寄主范围较广。当前农业生产中，防治芒果病害仍以高效、快速的化学药剂为主[5]，但化学药剂对环境及芒果的产量和品质都会产生不良影响，因此，开展绿色防控对促进我国芒果产业优质、健康发展具有重要意义[6]。

纳米材料具有表面和界面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应及宏观效应等超常特性，因而受到了广泛的关注[7-9]。目前，纳米材料已被应用于环境能源、航空航天、生物医药等多个领域。纳米技术极大地促进了农药的可持续发展，2019年，国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）将纳米农药评为未来改变世界的化学领域十大新兴技术之首[10]。研究表明，纳米材料可以作为新型的杀菌剂，且其与传统无机抗菌剂相比，具有更优良的抗菌效果[11-12]。Diem等[13]研究表明，纳米银和纳米金对水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）和水稻稻瘟菌（Pyricularia oryzae Cav.）具有较好的抑菌活性。蒲丽等[14]报道，纳米二氧化钛对烟草青枯菌（Pseudomonas solanacearum）的抑制率可达90%以上。但是这些纳米材料都存在一定的生物毒性且价格昂贵。因此，研发健康、廉价的新型抗菌材料具有重要意义。纳米氢氧化镁是一种新型无机材料，由于其具有低成本、环境友好等特点，已被广泛应用于重金属吸附、废水处理和阻燃剂等领域[15]。此前，郑军[15]系统地研究了纳米氢氧化镁的广谱抗菌性能，发现纳米氢氧化镁对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等都具有显著的抗菌活性；Dong等[16-17]发现纳米氢氧化镁悬浮液对大肠杆菌具有抑菌效果；陈蓉等[18]研究了纳米氢氧化镁对茶叶黑斑病原菌的抗菌活性。上述结果表明纳米氢氧化镁是一种优良的抗菌材料。然而，在组成成分相同的情况下，不同尺寸、形貌、聚集状态和表面电荷的纳米材料表现出不同的抑菌活性。刘慧颖等[19]研究了氧化锌微/纳米颗粒对食源性致病菌的抑制效果，发现棒状和梭状氧化锌的抑菌效果优于空心球状和蜂窝状氧化锌的抑菌效果，而相同形貌的氧化锌，颗粒尺寸越小的抑菌活性越大。王俊怡等[20]利用水热法制备的不同形貌氧化镁（球状、块状）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都表现出不同的抗菌性能。因而，为了选择适当的纳米氢氧化镁作为抗菌剂，需对不同形貌、尺寸的纳米氢氧化镁抑菌活性进行评估。

本研究从芒果危害部位分离病菌，经形态特征与分子鉴定结果确定分离的菌株为芒果拟茎点霉叶斑病病原菌，制备了3种不同形貌的纳米氢氧化镁，比较了不同纳米氢氧化镁对芒果叶斑病病原菌的抑制活性，以期为高效环保纳米氢氧化镁抗真菌制剂的研制提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 芒果叶斑病病叶样品采自福 建 农 林 大 学 仓 山 校 区（N26°05′9.35″，E119°14′0.57″）芒果树。

1.1.2 实验试剂 葡糖糖、琼脂粉、轻质氧化镁（MgO）、MgCl2·6H2O、NaOH均购自上海国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 PDA固体培养基 200 g马铃薯切碎，加蒸馏水煮沸，捣成泥状，经纱布过滤，收集滤液。在滤液中加入20 g葡萄糖、20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL，高压蒸汽灭菌，备用[21]。

1.2 方法

1.2.1 病菌的分离和培养 将病叶表面清洗消毒后，于病健交界处切取5 mm×2 mm叶片，经无菌水清洗，使用75%的酒精表面消毒，使用1 g·L-1氯化汞再次消毒5 min，无菌水冲洗3～5次后控干水分[22]。将处理后的组织样本以环形方式排列于培养皿，每皿放置3～4片，28℃恒温培养3～5 d。待长满菌丝后，于菌丝边缘处用灭菌的枪头打孔，置于新的培养皿中央进行培养，重复以上操作3次后得到纯化菌株，并将其置于4℃冰箱保存，命名为FAFU20190827。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定 将供试菌株接种到PDA培养基上，于28℃条件下培养6～8 d，产孢后挑取病原菌经制片、压片，在光学显微镜下观察菌丝大小、结构与形状，并根据菌落的生长特征（颜色、大小等）初步确定其属和种[22-23]。

1.2.3 ITS序列分析 使用CTAB法提取病原真菌DNA，操作方法参照全式金DNA抽提试剂盒。以DNA为模板，利用真菌核糖体基因转录间隔区通 用 引 物 ITS1（5’-TCCGAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌ITS区域进行PCR扩增。PCR反应体系[25]：ddH2O 9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，DNA 模板 1 μL。扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，片段回收后送福州铂尚生物技术有限公司测序。

将获得的序列在GenBank数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行 BLAST 比对，寻找近似的真菌种系，采用NJ法构建菌株系统进化树，最终确定其种类。

1.2.4 纳米氢氧化镁制备 ①MHNPs-MgO600制备[26]：2 g MgO在马弗炉中600℃加热2 h，取出后迅速加入到快速搅拌的500 mL ddH2O中，室温搅拌过夜。②MHNPs-MgO80制备[27]：将2 g MgO加入80℃纯水中搅拌24 h。③MHNPs-MgCl2的制备[18]：7 g MgCl2·6H2O加 10 mL ddH2O 搅拌溶解，2.76 g NaOH加10 mL ddH2O搅拌溶解，将NaOH溶液缓慢加入MgCl2·6H2O溶液，搅拌过夜。

所有样品均经10 000 r·min-1离心收集，使用ddH2O洗涤3次，得到的产物80℃烘干并研磨。

1.2.5 纳米氢氧化镁表征 使用X-射线衍射分析（XRD，PANalytical X’Pert PRO，40 kV，40 mA）和扫描电镜（SEM，JSM-6700F，FEI Co.，USA）对纳米氢氧化镁的尺寸和形貌进行分析和观察，借助Jade6.5分析XRD 数据，由谢乐（Scherrer）公式（式1）计算合成的纳米颗粒在（101）面的尺寸。

式中，D为晶粒垂直于晶面方向的平均厚度，K为Scherrer常数，B为样品衍射峰半峰高宽度，θ为布拉格角，λ为X射线波长，为1.54Å。

1.2.6 抑菌实验 使用平板涂布法评估纳米氢氧化镁的抑菌效果。分别配制质量浓度为5、25和50 mg·mL-1（分别为T1、T2、T3）的不同形貌纳米氢氧化镁的悬浊液，涂布前用超声清洗仪30℃超声30 min，作为样品备用。在PDA培养基中加入50 μL纳米氢氧化镁悬浮液，并在培养基表面均匀涂布，自然晾干后，将直径为8 mm的真菌菌饼接至培养基中央。同时以加入等量无菌水的PDA平板作为空白对照（CK），每组设置3个重复。28℃恒温培养，采用十字交叉法分别测量3、4和5 d的菌落直径，设置3次重复，计算菌丝生长抑制率[27]。采用SPSS v26进行单因素方差ANOVA分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌株的生物学表征

2.1.1 病原菌形态学特征 从图1可以看出，分离的病原菌菌丝初为乳白色、表面平坦，经过一段时间后菌丝呈丝绒状，平铺生长，可见其具有环状白色同心纹，菌丝密集且中央区域趋于暗黄偏褐。在显微镜下观察芒果叶斑病病原菌菌丝分枝，壁薄，呈暗褐色，有膈膜缢缩现象，经常缠绕形成菌丝环，未见产孢结构。

图1 病原菌形态Fig.1 Morphology of pathogen

2.1.2 病原菌的分子生物学鉴定 将ITS扩增片段测序结果与GenBank数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的序列进行比对，从比对结果中选择种属较近的菌株序列，以NJ法构建系统进化树，结果显示，菌株FAFU20190827在进化树上归属于间座壳属（Diaporthe musigena）（图2）。

图2 基于ITS序列的NJ-系统发育树Fig.2 NJ-system phylogenetic tree based on ITS sequence

2.2 纳米氢氧化镁的表征

2.2.1 纳米氢氧化镁的形貌比较 采用XRD及SEM分析纳米氢氧化镁的尺寸和形貌。结果（图3）表明，不同方法合成的3种纳米氢氧化镁样品与标准数据库卡片（JCPDF-044-1482）的特征峰一致。SEM结果表明，合成的纳米氢氧化镁呈现不同的形貌，且较易团聚成微粒。在600℃下，通过水热法合成的纳米氢氧化镁形貌为薄片状（图3A），在80℃下合成的为花瓣状（图3B），而通过化学沉淀法合成的纳米氢氧化镁形貌为六边形（图3C）。根据谢乐公式求得3种纳米氢氧化镁在(101)面的尺寸分别为60.50、13.53和11.62 nm。

图3 不同方法制备的纳米氢氧化镁的XRD和SEM图Fig.3 XRD and SEM images of nano-Mg（OH）2prepared by different methods

2.2.2 纳米氢氧化镁比表面积和Zeta电位 从图4可以看出，MHNPs-MgO600、MHNPs-MgO80和MHNPs-MgCl2样品的比表面积分别为（14.88±0.10）（92.61±0.52）和（77.42±0.64）m2·g-1，这表明，以氧化镁作为原料合成氢氧化镁时，600℃的高温不利于纳米氢氧化镁的孔隙形成，使得其比表面积远小于在80℃下合成的氢氧化镁，而选用氯化镁为原料合成的纳米氢氧化镁的比表面积略小于利用氧化镁在80℃下合成的氢氧化镁。因此，不同的合成原料和温度都会对纳米氢氧化镁的比表面积产生影响。3种纳米氢氧化镁的表面Zeta电位分别为（47.28±1.89）（26.65±1.64）和（32.15±1.25）mV，MHNPs-MgO80具有最低的表面电荷，在水溶液中的稳定性低于另外2种纳米氢氧化镁。不同合成方法制备的纳米氢氧化镁在形貌、尺寸和表面积等物理化学性质上都存在较大的差异[28]，且不同方法合成纳米氢氧化镁的抗菌活性也与其理化性质直接相关[26]。

图4 不同方法制备的纳米氢氧化镁的比表面积和Zeta电位Fig.4 BET surface area and Zeta potential of nano-Mg（OH）2prepared by different methods

2.3 不同纳米氢氧化镁对芒果叶斑病原真菌的抑菌效果

从图5可以看出，加入纳米氢氧化镁的平板上病菌生长直径明显减小，说明3种纳米氢氧化镁对芒果叶斑病原真菌的生长均具有较好的抑制作用，抑菌作用由高到低依次为：MHNPs-MgO80＞MHNPs-MgO600＞MHNPs-MgCl2，且纳米氢氧化镁的质量浓度越大，抑菌效果越明显。

图5 纳米氢氧化氢处理后芒果叶斑病原菌生长情况Fig.5 Pathogen growth of mango phoma leaf spot treated with different nano-Mg（OH）2

25 mg·mL-1的3种纳米氢氧化镁对菌丝生长抑制率都在40%以上，而MHNPs-MgO80在50 mg·mL-1时菌丝生长抑制率可达71.11%（表 1）。抗菌实验结果表明，3种纳米氢氧化镁的抗菌效果存在较大的差异，这可能和上述理化性质等直接相关。

表1 不同质量浓度的纳米氢氧化镁对芒果叶斑病原菌的抑菌率Table 1 Inhibition rate of pathogen of mango phoma leaf spot at different concentrations for three nano-Mg（OH）2

3 讨论

使用化学杀菌剂防治植物病害是保证农作物高产、稳产的重要措施之一，但是病原菌很容易对化学杀菌剂产生抗性，最终导致化学防治失败[29]。相对于有机和天然类抗菌剂而言，无机纳米材料具有毒性低、对环境生态和人类健康危害小且热稳定性较高以及病原菌不容易产生抗性等优点[26-27]。纳米氢氧化镁具有持久和广谱的抗菌活性，是一种安全无毒、环境友好、应用潜力巨大的抗菌材料[15]。相对于其他纳米材料，纳米氢氧化镁的来源简单且成本低。目前，关于纳米氢氧化镁抑菌性能的研究主要评估单一形貌的纳米氢氧化镁对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等模式病原菌的抑菌活性，但分析纳米氢氧化镁对水果病害的抑菌活性差异，以及形貌和尺寸对其抑菌活性影响的研究却鲜有报道。

本研究从芒果叶片中分离得到病原真菌，经形态和分子鉴定确认其为芒果茎点霉叶斑病病原菌，该病原菌主要危害叶片，使叶片产生斑点、干枯，影响芒果的光合作用。芒果叶斑病作为芒果生产中比较普遍的一种病害，对我国芒果的产量和品质都产生了巨大的影响。本研究合成制备的3种纳米氢氧化镁对芒果叶斑病原真菌都具有良好的抑菌活性，且质量浓度越高，抑菌活性越强，其抑菌活性大小表现为MHNPs-MgO80＞MHNPs-MgO600＞MHNPs-MgCl2，这与 3种纳米氢氧化镁的比表面积大小趋势一致，表明比表面积是影响纳米氢氧化镁抑菌活性的因素之一。此外，通过Zeta电位结果，推测3种纳米氢氧化镁颗粒对芒果叶斑病原真菌具有不同的抑菌性能的原因可能是它们具有不同的表面电荷，与病原菌表面的吸附能力存在差异，而在电荷的相互作用下被吸引在病原菌表面的纳米颗粒能破坏病原菌细胞壁的完整性并且增加细胞膜的通透性，最终导致病原菌的死亡。真菌的电位一般为负电，MHNPs-MgO80具有较小的表面电荷和最大的比表面积，更易于与病原菌接触，因而MHNPs-MgO80的抑菌效果更好。研究表明，纳米材料抗菌机理主要有活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、金属离子溶出和接触灭菌等[12]，同时纳米氢氧化镁可以通过接触破坏细胞膜，导致内容物流出和通过胞吞作用进入细胞内，在细胞内释放大量OH-，使菌体的DNA和蛋白质损伤变性，从而导致菌体死亡[16-17]。但本研究尚未对纳米氢氧化镁对芒果叶斑病病原真菌的抑菌机制进行研究，还有待深入探索。

本研究制备的3种不同形貌的纳米氢氧化镁对芒果叶斑病病原真菌均具有显著的抑制效果，其抗菌效果的差异与其自身的电荷、比表面积等理化性质以及抗菌剂的质量浓度相关。不同方法合成的纳米氢氧化镁虽然对病原真菌都具有一定的抗菌性，但它们的抗菌性能存在较大的差异，这说明在选择高效纳米抗菌剂时应考虑其合成方法、理化性质等对抗菌效果的影响。本研究为筛选合适的纳米抗真菌制剂提供了新的研究思路，也为纳米材料在农业病原菌的防治提供理论指导。今后可考虑将纳米氢氧化镁颗粒作为一种抗菌材料应用于果树病害的绿色防控，一方面能减少传统化学农药的使用，提高我国水果产业的品质和产量，另一方面能降低对环境的影响，保障人们的健康生活。