水稻籽粒镉积累KASP分子标记LCd-38的开发与利用

徐君， 李婷， 胡敏骏， 蒋玉根， 闫慧莉， 许文秀，虞轶俊， 何振艳*

（1.杭州市富阳区农业技术推广中心，杭州 311400；2.中国科学院植物研究所，北方资源植物重点实验室，北京 100093；3.中国科学院大学，北京 100049；4.浙江省耕地质量与肥料管理总站，杭州 310000）

镉（cadmium，Cd）是一种剧毒的重金属，半衰期为10～30年，可通过食物链在人体中富集，危害人类健康[1]。我国农用地镉污染现状不容乐观，2020年《中国生态环境状况公报》提出，影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属，其中镉是首要污染物。水稻（Oryza sativa L.）是我国主要粮食作物之一[2]，在生长过程中易从土壤中吸收镉，长期食用镉污染的大米会导致严重的健康问题[3]。

镉低积累水稻品种的选育可有效降低水稻籽粒镉污染风险，实现镉污染土地上的水稻安全生产，常用的方法包括常规选育和分子标记辅助选育[4]。常规选育基于不同品种的籽粒镉积累表型进行筛选，其过程耗时长，易受到环境因素影响，表型稳定性差。分子标记辅助选育利用与镉积累性状紧密连锁的DNA分子标记或功能标记，对镉积累性状进行间接选择，再结合常规育种手段培育新品种。分子标记辅助选育具有高效、准确、结果稳定的优点，提升了筛选的准确性和稳定性，可降低育种成本[5]，是目前镉低积累水稻品种选育的主要方法之一。

目前报道的籽粒镉积累相关分子标记包括Tons和OsHMA3[4]。王天抗等[6]基于珞红4A的7号染色体缺失片段处的插入序列（Tons）开发了分子标记，并利用开发的Tons分子标记检测体系从珞红4A与IR28杂交F2群体的后代中筛选到低镉新材料Tonys。Takahashi等[7]以OsHMA3为分子标记从2个粳稻品种杂交衍生的F5世代筛选到镉污染修复水稻材料Akita110。黄湘桂等[8]以OsHMA3作为分子标记，创制了基于创5S（C5S）背景的包含抗稻瘟病双基因和镉低积累基因OsHMA3的3基因聚合系。水稻籽粒镉积累性状是多基因控制的数量性状，现有的水稻籽粒镉积累相关分子标记远不能满足镉低积累水稻品种选育的实际需求。随着全基因组测序和全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）的发展，在水稻中挖掘到大量籽粒镉积累相关QTL（quantitative trait locus）[9-11]，为水稻籽粒镉积累相关基因的筛选与分子标记的开发提供了重要参考。

分子标记的开发主要基于Southern杂交、PCR技术和测序技术等。限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记是以DNA/DNA杂交为基础的第一代分子标记，由于检测技术繁杂，难以应用到大规模育种实践[12]。基于PCR技术的分子标记包括随机扩增多态 性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）标记[13]、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记[14]和序列标签位点（sequencetagged site，STS）标记[15]等二代分子标记，由于稳定性差、开发费用高，发展也受到了限制。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记是基于测序技术的分子标记[16-17]，与前两代分子标记相比，具有密度高、结果稳定且可自动化分析的优点，已成为重要的、有前景的分子标记[18]。目前竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技术在水稻分子标记辅助育种中广泛应用[19-24]。KASP技术是基于已知SNP的高通量基因分型技术，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断[25-26]，在大批量样本基因型鉴定时具有显著优势[26]。

根据《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》（GB 15618—2018）[27]，农田土壤分为优先保护类、安全利用类与严格管控类，其中，优先保护类土壤污染风险低，对食用农产品质量安全一般不构成威胁；严格管控类土壤污染风险高，原则上禁止种植食用农产品；安全利用类土壤可能存在不符合食用农产品质量安全标准的风险，采取安全利用措施（如种植低积累品种）等可降低该风险。

本实验室前期根据水稻微核心种质材料的籽粒镉含量全基因组关联分析结果鉴定到镉转运基因OsCd38[9]，该基因参与籽粒镉积累过程。本研究基于OsCd38基因上的籽粒镉积累显著相关功能性SNP位点TagSNP-20089955开发了KASP分子标记LCd-38，该标记可准确将不同品种分为高镉基因型（CC）和低镉基因型（TT）。利用LCd-38标记筛选适合安全利用类土壤种植的低镉水稻品种，该标记对试验地区不同主栽品种籽粒镉积累特性的预测准确率为100%。因此，LCd-38分子标记可用于水稻籽粒镉积累特性的早期预测，对镉低积累水稻分子标记辅助育种具有重要价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料与镉处理

供试水稻材料共85份，来源于水稻微核心种质（mini-core collection，MCC）材料（由中国农业大学提供）[9]，包括38个粳稻品种、47个籼稻品种，可以较少的种质数量代表较大的遗传变异[28]，其中，65个水稻品种（26个粳稻品种、39个籼稻品种）用于标记开发，剩余20个水稻品种（12个粳稻品种、8个籼稻品种）用于标记验证。水稻材料播种在大田，待幼苗株高15 cm时移栽至10 L塑料桶（土壤同大田）中，用硫酸镉（3CdSO4·8H2O）处理，处理水平为0.18 mg·kg-1。

1.2 水稻籽粒样品采集与镉含量测定

待水稻完全成熟后，收集水稻籽粒。收集的籽粒于40℃烘干3 d，脱壳后使用冷冻混合型研磨仪MM400（德国Retsch公司）粉碎；称取0.2 g（精确到0.000 1 g）样品放入消煮管中，加入1 mL HNO3冷消化过夜；用远红外控温式消煮炉（LWY84B型，江苏盛蓝仪器制造有限公司）200℃消解8 h，定容至15 mL，过滤至10 mL离心管中待测；以大米粉成分分析标准物质（GBWE100349，钢研纳克检测技术公司）为质控标准，确保数据准确可靠。采用电感耦合等离子质谱仪（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）测定籽粒镉含量，每个样品测量3次，取3次测定的平均值作为该样品镉含量的最终结果。

1.3 功能性SNP位点的筛选

基于前期鉴定的镉转运相关基因OsCd38，利用HaploView软件对基因序列上的35个籽粒镉积累相关SNP位点进行连锁不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），以r2＞0.8为紧密连锁指标，筛选水稻籽粒镉含量显著相关的标签SNP位点。通过t检验分析各标签SNP位点不同基因型对应的籽粒镉含量之间是否存在显著性差异，选取差异显著的SNP位点作为功能性SNP位点。

1.4 KASP标记开发与引物设计

根据功能性SNP位点的等位变异设计KASP标记，根据SNP位点的侧翼序列设计PCR扩增引物，包括特异性正向引物F1和F2，以及通用反向引物R（表1）。等位基因特异性引物各自具有对应于通用荧光共振能量转移盒的独特尾部序列，F1尾部用6-羧基荧光素（FAM）染料标记，F2尾部用六氯-6-甲基荧光素（HEX）染料标记。引物F1与通用引物的单链DNA分子用于扩增SNP位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；引物F2与通用引物的单链DNA分子扩增SNP位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。引物序列由中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司合成。

表1 LCd-38分子标记引物序列Table 1 LCd-38 molecular marker primer sequence

1.5 分子标记的验证

将浙江省杭州市富阳区的主栽水稻品种种植于安全利用类镉污染土壤，插秧后分别采集19个水稻品种的叶片，由中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司提取基因组DNA，用引物组进行PCR扩增并检测，确定各水稻品种分子标记位点的基因型。待成熟后按照1.2中所述方法检测其籽粒镉含量，评估分子标记鉴定结果的准确性。

2 结果与分析

2.1 水稻籽粒镉积累关联SNP位点的鉴定

实验室前期对水稻微核心种质材料的籽粒镉含量进行全基因组关联分析，从中定位到12个QTL并鉴定到1个籽粒镉转运相关基因OsCd38[9]。OsCd38基因序列上共有35个SNP位点，对这些SNP位点进行连锁不平衡分析（图1），共筛选出6个标签SNP位点。对6个SNP位点的不同等位基因型对应的籽粒镉含量进行显著性差异分析，结果（图1）显示，SNP6位点不同等位基因型对应的籽粒镉含量之间存在显著性差异。SNP6位于日本晴10号染色体上第20 089 955位，其核苷酸为C或T。65个水稻品种中，18个水稻品种的TagSNP-20089955位点基因型为TT，籽粒镉含量平均值为0.143 mg·kg-1；47个水稻品种的TagSNP-20089955位点基因型为CC，籽粒镉含量平均值为0.423 mg·kg-1（表2）。结果表明，TagSNP-20089955位点核苷酸种类为T的品种水稻籽粒镉含量均值显著低于该位点为C的水稻品种均值，该位点的等位变异可有效鉴别不同基因型水稻品种的籽粒镉积累特性，可作为功能性SNP位点。

图1 TagSNP-20089955的筛选与基因分型Fig.1 Screening and genotyping of TagSNP-20089955

表2 不同基因型水稻种质材料的籽粒镉含量Table 2 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice

2.2 LCd-38分子标记的开发与基因分型

根据设计的KASP引物，从65份水稻微核心种质资源材料中选取10个水稻品种，其中5个品种为TT基因型，5个品种为CC基因型，利用LCd-38进行鉴定。结果（图2）显示，5个品种的信号点为蓝色，5’末端连接FAM荧光标签序列的引物竞争性扩增，表明其基因型为TT；5个品种的信号点为红色，5’末端连接HEX荧光标签序列的引物竞争性扩增，表明其基因型为CC；阴性对照NTC（no template control）不产生荧光信号。LCd-38对10个微核心水稻品种基因型鉴定结果与实验室前期测序结果一致，表明LCd-38标记开发成功。

图2 LCd-38分子标记对不同基因型水稻种质材料的KASP分型Fig.2 KASP genotyping of different genotypes by LCd-38

2.3 LCd-38分子标记的验证

根据开发设计的KASP引物，选取另外20份微核心种质库水稻材料进行基因型分型，以20份微核心水稻品种的籽粒镉含量平均值0.322 mg·kg-1为标准。结果（图3）显示，LCd-38标记位点可以准确地聚类相同基因型的种质材料，各信号点的荧光信号值较高。阴性对照NTC单独聚集在一起，不产生荧光信号。利用基因型对材料进行分类，与籽粒镉含量测定结果进行比对，其中7个水稻材料为低镉基因型TT（蓝色点），籽粒镉含量平均值为0.134 mg·kg-1，所有水稻品种籽粒镉含量均低于0.322 mg·kg-1；2个水稻材料为杂合基因型（绿色点），籽粒镉含量平均值为0.436 mg·kg-1；11个水稻材料为高镉基因型CC（红色点），籽粒镉含量平均值为0.421 mg·kg-1，所有水稻品种籽粒镉含量均高于0.322 mg·kg-1（表3）。结果表明，该标记能够有效区分2种纯合基因型，且能够鉴别出杂合基因型，具有共显性特点。此外，KASP基因型读取时按照样品颜色来鉴定基因型，更为方便高效[29]。

图3 LCd-38分子标记对水稻种质材料籽粒镉含量预测结果Fig.3 Results of LCd-38 markers on the grain Cd concentration of rice germplasm

2.4 利用LCd-38标记筛选镉低积累水稻品种

2.4.1 试验地区主栽品种基因型与籽粒镉含量分析 为了筛选适合试验地区种植的镉低积累水稻品种，利用LCd-38对当地主栽品种进行基因分型。结果（图4）显示，5个水稻品种的LCd-38分子标记位点为低镉积累基因型TT，分别为嘉67、秀水121、绍糯9714、秀水14和嘉58；9个水稻品种的分子标记位点为杂合基因型CT；5个水稻品种的分子标记位点为高镉积累基因型CC，分别为嘉5-258、甬优17、甬优217、泰两优217和嘉禾218。

以全部待筛选水稻品种的籽粒镉含量平均值0.312 mg·kg-1为标准，结合水稻品种的籽粒镉含量与基因分型结果（表4）进行分析。结果表明，9个基因型为CT的水稻品种籽粒镉含量范围为0.021～0.786 mg·kg-1，变异系数达 98.66%，其中 7个水稻品种籽粒镉含量低于0.312 mg·kg-1，2个品种籽粒镉含量高于0.312 mg·kg-1；5个基因型为TT的水稻品种籽粒镉含量均值为0.048 mg·kg-1，均稳定低于0.312 mg·kg-1；5个基因型为CC的水稻品种籽粒镉含量均值为0.672 mg·kg-1，均稳定高于0.312 mg·kg-1。

表4 试验区不同基因型水稻品种籽粒镉含量Table 4 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice in experimental area

2.4.2 试验地区适种的镉低积累水稻品种筛选以《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[30]中规定的水稻籽粒镉限量值0.200 mg·kg-1为标准，5个基因型为TT的水稻品种籽粒镉含量最小值为0.017 mg·kg-1，最大值为0.066 mg·kg-1，均低于0.200 mg·kg-1；9个基因型为CT的水稻品种呈现出超标与不超标两种情况；5个基因型为CC的水稻品种籽粒镉含量范围为0.265～1.059 mg·kg-1，均高于 0.200 mg·kg-1。

试验区19个水稻品种中，SNP分子标记位点核苷酸种类为TT的品种水稻籽粒镉含量均值显著低于该位点为CC水稻品种籽粒镉含量均值（图4）。100%的基因型为TT的水稻品种中籽粒镉含量未超过0.312 mg·kg-1，也未超过国家食品安全标准限量值0.200 mg·kg-1，100%的基因型CC的水稻品种籽粒镉含量均高于标准0.312 mg·kg-1，也高于国家食品安全标准限量值0.200 mg·kg-1。因此，嘉67、秀水121、绍糯9714、秀水14和嘉58适合在富阳区安全利用类土壤种植；嘉5-258、甬优217、甬优17、泰两优217和嘉禾218为镉高积累水稻品种，需谨慎种植；杂合基因型的水稻品种的籽粒镉积累特性介于高低积累特性之间，该标记不适合位点为杂合基因型的水稻品种籽粒镉积累特性鉴定。

图4 试验地主栽水稻品种的KASP基因分型和籽粒镉含量Fig.4 KASP genotyping and grain Cd content of 19 rice varieties in experimental area

3 讨论

水稻是我国三大主粮作物之一，稻米镉超标问题威胁居民食品安全。选育镉低积累水稻品种可有效降低稻米镉污染风险。在常规筛选中，水稻籽粒镉积累表型易受稻田土壤环境、水肥管理措施、气候变化等外界环境因素的影响而不稳定，且由小范围试验到大田推广所需的时间长，因此不能满足稳定高效的筛选需求。分子标记辅助选育是利用与籽粒镉积累性状紧密连锁的基因设计分子标记来进行基因型筛选，再结合常规育种方法培育新品种的技术，具有高效准确且不受环境干扰的优点。

本研究基于籽粒镉积累转运基因鉴定到功能性SNP位点TagSNP-20089955，该位点核苷酸种类为T的水稻品种籽粒镉含量均值显著低于该位点为C的水稻品种籽粒镉含量均值。根据其基因分型设计了KASP分子标记LCd-38用于镉低积累水稻品种的选育。与前代分子标记相比，KASP技术具有操作简便、结果准确、成本较低的优点，只需以叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增即可，在SNP位点基因型的鉴定上已得到广泛应用。验证结果显示，KASP分子标记LCd-38可以准确地聚类相同基因型的材料。

浙江省杭州市富阳区稻田土壤镉含量平均值高于浙江省与中国土壤镉含量背景值，高风险区域主要集中在城镇和工矿企业周边农田[31-33]；部分水稻籽粒镉含量超过了《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定的0.200 mg·kg-1[33-34]。本研究选取富阳区安全利用类稻田为试验地，筛选适合当地种植的镉低积累水稻品种以降低籽粒镉污染风险。利用分子标记LCd-38对当地主栽品种进行基因分型的结果表明，该标记可精确地将不同水稻品种分为高镉基因型（CC）和低镉基因型（TT）。筛选到的5个低镉基因型水稻品种籽粒镉含量均未超过0.200 mg·kg-1，符合食品安全国家标准限量值，在试验区土壤镉污染条件下，可被列为镉低积累水稻品种，该示例对于镉低积累水稻材料的创制也具有参考价值。

水稻籽粒镉积累性状是多基因控制的数量性状，其中有主效基因，也有微效基因，单一考虑某个基因的SNP位点无法实现对所有水稻品种籽粒镉积累特性的准确预测。基因型位点为杂合型的水稻品种籽粒镉含量变异系数大，目前开发的分子标记只能针对纯合基因型水稻品种进行预测，无法准确鉴定杂合基因型水稻品种的籽粒镉积累特性，未来仍有待于开发更多的分子标记，通过多标记联合检测体系以实现不同基因型水稻品种镉积累特性的精准鉴定。