安石榴甙对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制研究

苏乙花，汪云鑫，陈学武

(海南省中医院 肿瘤科，海南 海口 570203)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是儿童和青少年最常见的恶性肿瘤，严重影响患者的生命健康。OS容易发生转移，转移性OS患者的5年生存率不足20%[1]。虽然近年来化疗技术不断提高，但是患者的总体生存率未见明显提高，仍有27%的接受化疗患者3年内出现局部复发[2]。另外化疗药物的毒副作用也严重影响了患者的生活质量，因此亟需寻找新的治疗策略。安石榴苷(punicalagin，PUN)是石榴皮多酚中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用[3]。PUN抗肿瘤活性的作用近年来逐渐受到重视。有研究发现，PUN可能通过影响细胞增殖、凋亡、自噬和细胞周期等抑制宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌和结直肠癌等的进展[4- 6]。PUN对OS的作用及其机制既往少有报道。分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白信号通路是一条在生物进化中极为保守的通路，在肿瘤细胞增殖和迁移中起重要作用[7]。在OS中，分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白信号通路与瘤细胞上皮间质转化(mesenchymal transition，EMT)密切相关[8]。本研究检测PUN对骨肉瘤U2OS和MG63细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并分析PUN对分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路和EMT的影响，旨在为PUN在OS治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

骨肉瘤U2OS和MG63细胞购于中国科学院上海细胞库。PUN购于草源康生物有限公司。主要试剂：RPMI 1640培养基、DMEM培养基、青霉素、链霉素和0.25%胰蛋白酶均购于上海捷瑞生物工程有限公司，结晶紫染色液购于北京索莱宝科技有限公司，Matrigel胶购于美国BD公司，蛋白提取试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，E钙黏蛋白、N钙黏蛋白、波形纤维蛋白、锌指蛋白转录因子(ZEB1、Snial、Twist)、β- 连环蛋白、c- Myc蛋白、细胞周期蛋白D1、内参β- 肌动蛋白(β- actin)抗体均购于美国Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用RPMI 1640培养基培养MG63细胞，DMEM培养基培养U2OS细胞。培养基中加入10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素，置于37 ℃、5%CO2条件下进行培养。

1.2.2 结晶紫法检测细胞增殖能力 将瘤细胞以5 000 个·孔-1密度接种于96孔板，用不同浓度PUN处理两种瘤细胞，分别设置为不加PUN的对照组和50、75、100 μmol·L-1PUN组，每组设5个复孔。分别培养24、48、72 h后取出1板，用PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛固定10 min。随后每孔加入200 μl结晶紫染色液，10 min后用蒸馏水清洗，干燥后观察染色情况。加入200 μl的10%乙酸，脱色20 min，用酶联免疫检测仪检测吸光度值，计算细胞相对增殖率。

1.2.3 细胞划痕愈合实验检测细胞迁移 将细胞接种于6孔板中，当细胞融合度为90%时，用10 μl移液器无菌枪头在细胞表面进行划痕。随后用含不同浓度PUN的2%血清培养液培养瘤细胞，记为0 h划痕宽度。观察和记录12、24 h时同一位置的细胞划痕宽度，计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%[9]。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移 将含有50 000个细胞的200 μl无血清培养基滴入Transwell小室的上室，此为细胞迁移实验。迁移时间约为12 h，随后进行侵袭实验，将50 000个细胞加入上室，涂上无血清培养基稀释的Matrigel，保持上室培养基中含有质量浓度为IC50的PUN。分别将800 μl含有10%胎牛血清的培养基加入下室。37 ℃条件下进行孵育，将膜底表面的瘤细胞用100%甲醇固定，随后用0.1%结晶紫染色液进行染色，30 min后在光镜下进行计数。

1.2.5 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平 用RAPI裂解液提取瘤细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，进行10%十二烷基磺酸钠- 聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗E钙黏蛋白(1∶500)、抗N钙黏蛋白(1∶1 000)、抗波形纤维蛋白(1∶200)、抗ZEB1(1∶500)、抗Snial(1∶500)、抗Twist(1∶1 000)、抗β- 连环蛋白(1∶500)、抗c- Myc蛋白(1∶1 000)或抗细胞周期蛋白D1(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育，次日除去一抗，用TBST缓冲液洗涤3次后加入羊抗兔二抗(1∶500)，封闭1 h。以β- actin作为内参，ECL发光仪进行蛋白成像，Image J软件分析灰度值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 PUN抑制U2OS和MG63细胞的增殖

用不同浓度PUN分别处理U2OS和MG63细胞，24、48及72 h时用结晶紫染色法检测细胞增殖能力。不同剂量PUN均可抑制U2OS和MG63细胞的增殖，并且存在剂量依赖性，PUN剂量越大细胞增殖能力越低(P<0.05)，见表1。

表1 各组细胞相对增殖率 %

2.2 PUN抑制U2OS和MG63细胞的迁移

用细胞划痕实验和Transwell实验检测U2OS和MG63细胞的迁移，结果显示，不同剂量PUN均可抑制瘤细胞迁移，并且存在剂量依赖性，PUN剂量越大细胞迁移越会被抑制(P<0.05)，见表2、3。

表2 各组细胞划痕愈合率比较 %

表3 各组迁移细胞数比较 个

2.3 PUN抑制U2OS和MG63细胞的侵袭

Transwell小室实验检测U2OS和MG63细胞的侵袭力，结果显示，不同剂量PUN均可抑制瘤细胞侵袭，并且存在剂量依赖性，PUN剂量越大细胞侵袭越会被抑制(P<0.05)，见表4。

表4 各组侵袭细胞数比较 个

2.4 PUN抑制U2OS和MG63细胞EMT

在U2OS和MG63细胞中，与对照组及50 μmol·L-1PUN组比较，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN组N钙黏蛋白、波形纤维蛋白及ZEB1、Snial、Twist蛋白表达水平较低，而E钙黏蛋白蛋白表达水平较高(P<0.05)，见表5、6。

表5 U2OS细胞中各组EMT相关指标蛋白相对表达量比较

表6 MG63细胞中各组EMT相关指标蛋白相对表达量比较

2.5 PUN抑制U2OS和MG63细胞分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路

在U2OS和MG63细胞中，与对照组比较，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN组β- 连环蛋白、c- Myc蛋白、细胞周期蛋白D1蛋白表达水平较低(P<0.05)，见表7。

表7 U2OS和MG63细胞中各组分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路相关指标蛋白相对表达量比较

3 讨 论

OS预后较差，局部和远处转移发生早，治疗效果不尽如人意[10- 11]。PUN是石榴皮多酚中的主要成分，占60%～70%，极性强，易溶于水，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血脂、抗肿瘤等作用[12- 13]。本研究以骨肉瘤U2OS和MG63细胞为研究对象，发现PUN可以抑制瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并且可抑制分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路和EMT。

PUN的抗肿瘤机制主要有以下几个方面：(1) 抗炎：PUN可通过抑制转录因子κB炎症信号通路阻滞癌细胞周期，诱导癌细胞凋亡[14]。(2) 促进凋亡和自噬：在结直肠癌的研究中，PUN可以通过调节膜联蛋白A1表达而促进癌细胞的凋亡和自噬[5]。(3) 诱导DNA损伤：PUN可促进共济失调毛细血管扩张突变基因编码蛋白(ATM)的磷酸化，进而诱导癌细胞DNA损伤，诱导细胞死亡[6]。(4) 抑制肿瘤细胞增殖和侵袭：PUN通过多种信号通路直接抑制瘤细胞的增殖和侵袭[14- 15]。

PUN抗OS的作用既往少有报道。本研究用结晶紫法、细胞划痕愈合实验、Transwell小室法分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力，发现50、75、100 μmol·L-1的PUN均可以抑制U2OS和MG63细胞的增殖、侵袭和迁移，并且存在剂量依赖性，剂量越高抑制作用越强。分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路在胚胎发育、组织再生和其他生理过程中起着重要作用，该通路的异常活化可诱导癌症的发生[7]。既往研究已证实，分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路在OS中存在异常活化，该通路激活后可促进瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[16- 17]。本研究发现，PUN可抑制分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路中关键蛋白β- 连环蛋白、c- Myc蛋白、细胞周期蛋白D1的蛋白表达，提示PUN可能通过抑制该通路的激活而抑制OS的发生和发展。

EMT与细胞的转移及侵袭有关，与癌症密切相关[18]。既往研究显示，分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路能调控EMT，参与肿瘤发生与发展[18]。E钙黏蛋白、波形纤维蛋白、N钙黏蛋白及ZEB1、Snial、Twist是EMT的标志蛋白[19- 20]。本研究结果显示，在U2OS和MG63细胞中，与对照组及50 μmol·L-1PUN组比较，75 μmol·L-1PUN及100 μmol·L-1PUN组N钙黏蛋白、波形纤维蛋白及ZEB1、Snial、Twist蛋白表达水平较低，而EE钙黏蛋白蛋白表达水平较高，说明PUN可以抑制EMT。

综上所述，PUN可能通过抑制分泌型糖蛋白/β- 连锁蛋白通路和EMT而抑制OS瘤细胞的增殖、侵袭、迁移。本研究也存在一些局限性，如：仅选取了U2OS和MG63两种OS细胞系；未分析PUN对凋亡、细胞周期等的作用；PUN对OS的抑制效果未在体内进行验证。未来有待开展动物研究，进一步探讨PUN对OS的抑制作用及其生物学机制。