MiR-3934 联合MRI 评估ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值：基于142例前瞻性研究

王雅静，李伟兰，谢宗源，李 晖，胡 雷

华北理工大学附属医院1核磁室，2放疗科，河北 唐山063000

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，高发于50～55岁，近年来其发病趋于年轻化［1］，全球每年宫颈癌新发病例约53万，死亡病例约27万［2］。同步放化疗是治疗宫颈癌的有效手段之一，若同步放化疗首次治疗失败，后续治疗将十分受限［3］。早期评估同步放化疗获益有着重要意义。

微小核糖核酸（miRNA）可通过调控靶基因参与宫颈癌发生发展过程［4］。miR-3934作为miRNA家族中一员，已被报道与肺腺癌［5］、神经母细胞瘤［6］和前列腺癌［7］等密切相关，但关于其与宫颈癌的关系还鲜有报道。针对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌（CESC）miRNA表达数据的分析结果显示miR-3934在宫颈癌中表达上调；也有证据表明MRI参数可反映宫颈癌同步放化疗疗效［8］。但目前，临床鲜有价值高的指标预判宫颈癌同步放化疗获益。本研究主要分析miR-3934联合MRI评估ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究为前瞻性研究，选取2019年8月～2021年9月在华北理工大学附属医院确诊并接受治疗的142例宫颈癌患者作为研究对象。ⅡB～Ⅲ期宫颈癌诊断参照《国际妇产科联盟（FIGO）2018癌症报告：宫颈癌新分期及诊治指南》［9］。纳入标准：首次确诊为宫颈癌；FIGO分期为ⅡB～Ⅲ期；接受同步放化疗；同步放化疗前未接受其他抗肿瘤治疗。排除标准：伴血液系统疾病或免疫系统疾病；哮喘或其他恶性肿瘤；年龄及肿瘤病理信息不完整；中途退出研究者。

142例患者的年龄为32～70（54.36±8.06）岁；BMI为23.39（21.29，24.99）kg/m2；国际妇产科联盟（FIGO）ⅡB期30例，ⅢA期39例，ⅢB期28例，ⅢC1期29例，ⅢC2期16例；腺癌38例，鳞状细胞癌104例；肿瘤直径5.7（4.8，6.2）cm；高分化62例，中分化51例，低分化29例。本研究受试者均签署了知情同意书，符合《赫尔辛基宣言》，经华北理工大学附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 MRI检查

于宫颈癌患者同步放化疗前用Ingenia 3.0 T全数字MR扫描仪（飞利浦）和体部表面线圈行盆腔MRI常规平扫、扩散加权成像（DWI）及动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）扫描。MRI 常规平扫包括矢状位、冠状位、轴位T2WI和轴位T1WI序列，DWI（b值分别为0、1000 s/mm2）序列和DCE-MRI轴位序列（T1 THRIVE序列）。分别在DCE-MRI伪彩图和ADC图上测量回流速率常数（Kep）值、容积转运常数（Ktrans）值、血管外细胞外间隙容积比（Ve）值和表观弥散系数（ADC）值。某患者的MRI检查图像示意（图1）。

图1 某患者的MRI检查图像Fig.1 MRI images of a patient.

1.3 数据下载

从TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）中下载关于CESC的312例样本（含309例宫颈癌样本和3例正常宫颈样本）的miRNA表达的定量分析数据。

1.4 同步放化疗方案及获益评价

同步放化疗方案：盆腔外照射放疗联合腔内后装放疗，并同步化疗。三维适形放疗，2 Gy/次，5次/周，持续5 周；三维适形放疗后用192Ir 腔内放疗，A 点剂量6～7 Gy/次，1次/周，共4～6次。顺铂剂量为40 mg/（m2·周），至放疗结束。

获益评价：用实体瘤反应评估标准［10］评价同步放化疗获益，完全缓解：肿瘤病灶消失，持续时间超过4周；部分缓解：肿瘤病灶缩小50%及以上，无新发肿瘤病灶，持续时间超过4周；疾病稳定：肿瘤病灶缩小低于50%或增大低于25%，无新发肿瘤病灶，持续时间超过4周；疾病进展：肿瘤病灶增大25%及以上或有新肿瘤病灶出现。

1.5 miR-3934水平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测miR-3934 水平。抽取宫颈癌患者同步放化疗前（t0）、同步放化疗第2天（t1）和同步放化疗第8天（t2）的肘部静脉血10 mL，4 ℃3000×g离心5 min，提取上层清液；用Trizol试剂提取血清中RNA；紫外分光光度计检测RNA纯度（本实验中RNA 的OD260/280值均为1.9～2.0）；用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA；用PCR仪扩增产物，反应条件95 ℃5 min，92 ℃30 s，65 ℃30 s，62 ℃1 min，40个循环。miR-3934上游序列：5'-GCCAGCTCCTACATCT CAGC-3'，下游序列：5'-AGCCTGACTTGCTAGTGG ATT-3'；内参U6上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3'，下游序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用2-DDct法计算miR-3934的相对水平。

1.6 统计学分析

采用R4.1.0软件对数据进行统计分析；采用edgeR包分析TCGA-CESC中miRNAs表达数据。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较行独立样本t检验，组内两时点间的比较行配对样本t检验，t0、t1和t2时点的miR-3934水平比较行重复测量方差分析；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距表示，两组间比较行Mann-WhitneyU检验。计数资料以n(%)表示，两组间比较行χ2检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价t0、t1和t2时点的miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值。采用Logistic回归分析ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的风险因素，并构建上述风险因素的列线图回归模型。用一致性指数（Cindex）评价模型的区分度，用校准曲线评价模型精准度，用决策曲线分析法评价模型临床应用价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA-CESC中差异miRNAs数据分析结果

TCGA-CESC 中共有110 个差异表达的miRNAs（foldchange=1，p.adj=0.05），其中46个miRNAs表达上调，64 个miRNAs 表达下调（图2A）。宫颈癌组织中hsa-miR-3934表达水平高于正常宫颈组织，差异有统计学意义（logFC=3.919，FDR=2.52E-04，P＜0.05，图2B）。

图2 TCGA-CESC差异miRNAs表达结果Fig.2 Results of differential miRNAs expression in TCGA-CESC.

2.2 两组临床特征比较

142例患者治疗后完全缓解16例，部分缓解51例，疾病稳定48例，疾病进展27例。根据治疗获益情况将其分为获益组（完全缓解+部分缓解，n=67）和非获益组（疾病稳定+疾病进展，n=75）。两组年龄、BMI、病理类型构成和肿瘤直径的差异均无统计学意义（P＞0.05）。获益组的FIGO ⅡB期占比和高分化占比均高于非获益组，淋巴结转移占比低于非获益组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 两组的临床特征比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics of the two groups

2.3 两组miR-3934水平比较

两组miR-3934 水平的差异有统计学意义（F=98.086，P＜0.001），获益组t0、t1和t2时点的miR-3934水平均低于非获益组（t=5.778、6.222和9.421，P＜0.001）；两组miR-3934 水平的时间差异有统计学意义（F=18.794，P＜0.001），两组的miR-3934水平随时间进展均呈降低趋势，获益组和非获益组t2时点的miR-3934水平均低于t0（t=5.593，P＜0.001；t=2.404，P=0.019）；时间和获益不存在交互效应（F=2.718，P=0.075），即获益组和非获益组的miR-3934水平变化差异无统计学意义［0.40（0.20，0.63）vs0.27（0.12，0.54），Z=1.518，P=0.129，表2］。

表2 两组的miR-3934水平比较Tab.2 Comparison of miR-3934 in the two groups(Mean±SD)

2.4 两组影像学参数比较

获益组的Kep值、Ktrans值和Ve值均低于非获益组，ADC值高于非获益组，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 两组的影像学参数比较Tab.3 Comparison of imaging parameters between the two groups(Mean±SD)

2.5 miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值

t2时点的miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的ROC曲线下面积（AUC）高于t0和t1，差异均有统计学意义（Z=2.204，P=0.028；Z=2.230，P=0.026）。t0和t1时点的miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的AUC差异无统计学意义（Z=0.102，P=0.919，表4、图3）。

表4 miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值比较Tab.4 Comparative value of miR-3934 in determining the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～III cervical cancer

图3 miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的ROC曲线Fig.3 ROC curve of miR-3934 in judging the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～III cervical cancer.

2.6 ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的风险因素分析

分别以t2时点的miR-3934、Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值的中位数为界值将上述变量转换为二分类变量。将ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗是否获益作为因变量，将FIGO 分期、淋巴结转移、分化程度、t2 时点的miR-3934、Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值作为自变量，变量赋值（表5），纳入多因素Logistic回归分析，结果显示FIGO Ⅲ期、淋巴结转移、分化程度低、t2时点的miR-3934＞2.66和Ktrans值＞0.59是ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗的独立危险因素（P＜0.05），ADC值＞0.52是ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗的独立保护因素（P＜0.05，表6）。

表5 变量赋值Tab.5 Variable assignment

表6 ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的logistic回归分析结果Tab.6 Logistic regression analysis results of benefits of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～III cervical cancer

2.7 ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的模型构建及评价

构建评价ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的模型A（由FIGO分期、淋巴结转移、分化程度、Ktrans值和ADC值组成）和模型B（由FIGO分期、淋巴结转移、分化程度、t2 时点的miR-3934、Ktrans值和ADC 值组成）（图4A～B）。模型A评价ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的C-index为0.969，低于模型B（0.986）。模型A和模型B的校准曲线（图4C～D）。模型A的均方误差和平均绝对误差分别为0.00046和0.02，均低于模型B（0.00098和0.03）。

当阈值概率在0.88～0.92时，模型A的临床价值大于模型B；当阈值概率在0～0.88或0.92～1时，模型B的临床应用价值大于模型A（图4E）。

图4 ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的模型构建及评价Fig.4 Model construction and evaluation of the benefit of concurrent chemoradiotherapy for stage IIB～III cervical cancer.

3 讨论

同步放化疗是ⅡB～Ⅲ期宫颈癌患者的首选治疗方案，其治疗疗效与患者结局密切相关［9,11］。临床中部分宫颈癌患者存在治疗抵抗，治疗后仍存在较大的复发及转移风险，预后的个体化差异较大［12］，因此，早期评估同步放化疗获益有利于进一步强化治疗。本研究主要分析miR-3934联合MRI评估ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值。

本研究结果显示获益组t0、t1 和t2 时点的miR-3934水平均低于非获益组，两组miR-3934水平随时间进展均呈降低趋势，获益组和非获益组t2时点的miR-3934水平均低于t0，上述结果提示miR-3934水平与ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益有关，是其潜在的评价指标。构建评价ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的ROC曲线，结果显示t2时点的miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的AUC为0.857，高于t0和t1，提示t2时点的miR-3934判断ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值最大，因此将其纳入Logistic回归分析。对获益组和非获益组的Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值进行比较，结果显示获益组的Kep值、Ktrans值和Ve值均低于非获益组，ADC值高于非获益组，上述结果提示Kep值、Ktrans值、Ve值和ADC值可能与ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益有关。

采用Logistic回归分析ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的风险因素，结果显示FIGO Ⅲ期、淋巴结转移、分化程度低、t2时点的miR-3934＞2.66和Ktrans值＞0.59是ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗的独立危险因素，ADC值＞0.52是ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗的独立保护因素。既往已有多项研究报道FIGO分期高、淋巴结转移和分化程度低与宫颈癌患者同步放化疗治疗反应差有关［13-15］。Ktrans值反映的是对比剂从血管进入组织间隙的速度，与组织血流量有关，多用来评估肿瘤病灶血管生成情况［16］。Ktrans值高，提示肿瘤病灶的血管完整性受到不同程度破坏，血管通透性增加［11］。ADC值可反映肿瘤病灶内分子扩散程度、水分子运动、血流状态及癌细胞代谢功能等，其数值与放化疗疗效密切相关［17］。目前，已有多数学者将MRI的影像学参数应用于宫颈癌患者治疗反应预测。有研究表明Ktrans值与局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者同步放化疗反应有关，是预测局部晚期宫颈鳞状细胞癌患者同步放化疗反应的潜在指标［18］；也有研究表明ADC值可反映宫颈癌患者同步放化疗的疗效，其值越大提示宫颈癌同步放化疗疗效越好［19］。本研究结果与上述研究结果一致。有证据表明鳞状细胞癌患者的预后明显强于腺癌［20］，本研究结果显示病理类型与ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益无关，推测该差异与样本量大小有关，后续还需增加样本量进一步分析。有研究报道，miR-3934与癌细胞对顺铂的敏感度有关，其可靶向肿瘤蛋白53诱导型核蛋白1参与A549细胞对顺铂的敏感性［21］。此外，miR-3934还被报道与神经母细胞瘤细胞的增殖和凋亡有关［6］。本研究推测miR-3934可调节宫颈癌细胞的增殖、凋亡及对顺铂的敏感度，其水平与宫颈癌细胞对同步放化疗的反应有关，进而反映同步放化疗获益情况。

本研究构建了评估ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的模型，结果显示模型A的C-index低于模型B，该结果提示模型B的区分度更好；模型A的均方误差和平均绝对误差略均低于模型B，该结果提示模型A的精准度略佳。此外，在大部分阈值概率内，模型B的临床应用价值大于模型A。综上，认为模型B更适用于宫颈癌同步放化疗获益评估。

综上所述，由FIGO分期、淋巴结转移、分化程度、t2时点的miR-3934、Ktrans值和ADC值组成的模型B评估ⅡB～Ⅲ期宫颈癌同步放化疗获益的价值较高，可辅助医生决策。本研究因样本量有限，未设置验证组，后续将扩大样本量进一步验证模型B的价值。