β分泌酶-1基因甲基化与阿尔茨海默病的相关性研究

孙 蓉，肖 琳，宋明洁，何静杰,贾建平

(中国康复研究中心 神经康复K2科，北京100068)

阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆力明显下降为主要表现的进行性神经系统变性疾病。流行病学和家系研究表明遗传因素在AD的发病中占有很重要的地位[1]。近年来AD基因学的研究取得了很大的进展。已确定与AD有关的基因分别为淀粉样APP(APP)基因[2-3]、载脂蛋白E(ApoE4)基因[4-5]、早老素1(PSEN1)基因[6]和早老素2(PSEN2)基因[7]。然而目前只有少数AD发现有这些基因的突变，并且部分突变并不致病[8]。以往的研究多侧重于对DNA本身序列的关注，而有些表型和疾病的发生并非DNA序列的改变[9]。国内外研究发现部分基因启动子区变异在某些人群中可能与AD的发病有关[10-12]。本研究检测中国北方汉族人群BACE1基因启动子区的甲基化水平，并通过遗传学分析其与AD发病的关系，为AD的发病机制及今后临床治疗提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

研究分为散发性阿尔茨海默病(SAD)组、轻度认知障碍(MCI)组和对照组，SAD组35例(男17例，女18例)，平均发病年龄63.5±5.3岁。符合美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会对AD临床诊断。一级亲属中无痴呆和精神病患者，属散发病例。MCI组33 例(男14例，女19例)，平均发病年龄64.2±5.8岁。经MMSE评分、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)、Hachinski缺血评分和门诊系统体检诊断。对照组22例(男11例，女11例)，平均年龄67.5±7.4岁，无记忆和智能障碍，MMSE评分>28分。3组间年龄、性别、教育程度上差异无显著意义，均已签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

甲基化修饰试剂盒购自美国Chemicon公司。Taq HS热启动酶购自大连宝生物公司。Massarray点样及芯片仪为美国Sequenom公司产品。PCR仪为美国ABI公司产品。GloMaxTM96微孔荧光分析仪为美国Promega公司产品。

1.3 方法

1.3.1DNA的提取及亚硫酸盐修饰 抽取静脉血10 ml，用枸橼酸葡萄糖(ACD)抗凝，盐析法提取DNA。用分光光度计分别测定260 nm、280 nm波长时的OD值。A260/A280比值大于2.0说明有RNA的污染，可用RNA酶处理样品；比值小于1.8说明有蛋白质污染，可用酚-氯仿抽提。按照Chemicon甲基化修饰试剂盒说明对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰及纯化回收。

1.3.2引物设计及PCR扩增 设计引物，扩增区域为BACE1启动子区-407至+61，片段大小为468 bp。引物由上海生工合成，序列为Forward:GTTGGTTGTTTAGGTTATTATAATTTAGTT;Rev

ers:TAAATCTTCCCAAATCCCTAAATA。在正向引物5’端加入10mer tag，用于平衡PCR反应；反向引物5’端加入T7-Promoter 序列，用于后续的体外转录。以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃变性15 min；94℃20 s，62℃30 s，72℃60 s，45个循环；72℃ 3 min；4℃ ∞。PCR反应产物使用2 μl碱性磷酸酶(SAP)处理，去除体系中游离的dNTP。

1.3.3体外转录及RNase A特异性T酶切 体外转录与酶切反应同时进行，反应体系包含SAP处理后PCR产物2 μl，RNase-free ddH2O 3.15 μl，5× T7 Polymerase Buffer 0.89 μl，T Cleavage Mix 0.24 μl，100 mM DTT,0.22 μl，T7 RNA & DNAPolymerase 0.44 μl，RNase A 0.06 μl。反应程序为37℃ 3 h，4℃ ∞。每个样品中加水20 μl稀释，震荡混匀，加入6mg Clean Resin树脂纯化10 min，3 200 g离心5 min。

1.3.4质谱检测 将纯化后产物点至384孔芯片上，使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测数据通过EpiTYPER软件(SEQUENOM)分析并输出结果。

1.3.5重组质粒的构建及细胞转染 以双荧光报告基因系统(pGL3-Basic及pRL-TK)为报告基因载体，用基因重组技术构建含BACE1基因启动子区的报告基因质粒，测序证实质粒构建成功。瞬时转染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞和人宫颈癌上皮(HeLa)细胞。在每次进行转染的过程中，同时转染pEGFP-N1质粒，观察绿色荧光蛋白表达情况，以证实每次转染的成功与否。

1.3.6细胞干预及相对荧光素酶活性检测 选取S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(复甲基化)、5-脱氧杂氮胞苷(5-aza-CdR)(去甲基化)、血清剥夺(降低能量和凋亡)及模拟AD病理环境(Aβ25-35)四种干预因素。转染后24 h，用不同剂量的各种处理因素作用细胞24 h，用MTT法计算细胞活力，选取适合浓度进行细胞干预。用GloMaxTM96微孔荧光分析仪检测LAF及LAR。相对荧光素酶活性(RLA)以表示不同启动子质粒的转录活性。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 启动子区CpG位点分析

BACE1基因启动子在-407 至+60区域有23个潜在甲基化位点。本次研究分析了前21个位点的甲基化水平(因检测技术限制，CpG16和CpG23未能检测)。

2.2 甲基化率的统计学分析

BACE1基因启动子区大多数CpG位点甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%。与MCI组和对照组相比，SAD组患者BACE1 启动子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位点甲基化率明显降低(P<0.01)。MCI组与对照相比，各位点甲基化程度的变化均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 BACE1基因启动子区CpG位点的甲基化率

2.3 年龄与甲基化率的相关性

BACE1基因启动子区平均甲基化率与年龄之间存在负性线性相关(相关系数R=-0.643，P<0.01)。随着年龄的增长，甲基化程度逐渐降低(图1)。

图1 基因启动子区甲基化率与年龄的相关性分析

2.4 不同处理因素下启动子的转录活性

选择SAM 255 μmol/L、5-aza-CdR 55 μmol/L和Aβ25-35 15 μmol/L作为最后的工作浓度，在这些浓度下细胞活力都在80%左右。对比各种处理因素下启动子质粒的RLA，无论是在SH-SY5Y细胞中，还是在HeLa细胞中， BACE1启动子质粒的转录活性在SAM干预下，与非处理组相比均明显下降(P<0.01)。而在Aβ25-35干预下，BACE1启动子质粒的转录活性与非处理组相比增加约20%，但这种变化仅在SY5Y细胞中(SY5Y细胞中P=0.000；Hela细胞中P=0.092)。双荧光基因报告分析表明启动子质粒在血清剥夺及5-aza-CdR干预下的RLA与非处理组相比均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 BACE1质粒在不同处理因素下的RLA比较

3 讨论

AD是老年期痴呆的主要原因之一，由德国巴伐利亚精神病学家Alois Alzheimer在1907年首先描述并以其名字命名。病理上表现为脑组织萎缩，在新大脑皮质、海马的神经元中有神经纤维缠结(NFTs)、细胞外老年斑(SP)和脑血管中淀粉样蛋白(Aβ)沉积[13]。AD的病因目前尚不清楚，以往主要理论是唯蛋白假说(protein-only)，直接归因于相关蛋白如β淀粉样蛋白等的聚集作用，然而蛋白聚集发生在后期，AD的发生和发展不能完全用唯蛋白模型解释[14]。

遗传因素导致疾病的发生主要有两大类机制：基因机制和表观遗传机制。基因机制指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、染色体丢失和重排；表观遗传机制是在基因的DNA序列和基因产物没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。随着AD遗传学研究的逐渐深入，越来越多的证据向“基因决定论”提出了挑战。FAD患者的研究[15]发现，即使具有完全相同基因组的两个孪生子，发病年龄、临床症状都不完全相同。这说明还有别的遗传学机制在FAD发生过程中也起着重要的作用。遗传学中的一个前沿领域：表观遗传学为人们提供了解答这类问题的新思路。1999年Wolffe[16]将表观遗传改变定义为未发生DNA序列改变的、可遗传的基因表达改变。这些表观遗传的变化与老化、生活方式、环境暴露和遗传因子密切相关，通过染色质重构、调控基因表达，影响细胞生理活性以及获得疾病的危险性与严重性[17]。表观遗传调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA三种方式，其中以DNA甲基化修饰最为常见。DNA甲基化是生物体在DNA甲基化转移酶(DNMTS)的作用下，以SAM为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上去的过程。

Lahiri DK[18]提出了“Latent Early-Life Associated Regulation”(LEARn)模型，假定特殊基因的潜在表达触发了AD的发生和发展。根据这个模型，各种影响因素开始于早期阶段，其长期的存在破坏了基因调节，如通过其转录机构干扰基因调节，导致相关蛋白过表达和随后的Aβ沉积。这个模型主要作用于基因的调控区(启动子)，通过特定基因启动子内特定位点的甲基化起作用。

β分泌酶是一种转膜天门冬氨酸蛋白酶—β位点APP裂解酶(BACE1和BACE2)，BACE1和BACE2被称为新的转膜天门冬氨酸(ASP)蛋白酶家族[19]。研究[20]表明由转录因子水平的变化造成BACE1 表达的升高可能部分地促进AD的病理进程，进一步导致AD发病。

本研究通过对35例AD患者、33例MCI患者和22例正常人外周血BACE1(-407 至+60)启动子区甲基化程度的检测，分析基因甲基化模式的改变在AD发病过程中所起的作用。BACE1基因在所研究的启动子区域分别有23个甲基化位点。我们研究了21个位点，其中大多数CpG位点甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%，与MCI组和正常对照组相比，SAD组患者BACE1 启动子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位点的甲基化程度明显降低。MCI组与正常对照相比，各CpG位点甲基化程度的变化均无统计学意义。由此可见，特定基因启动子区甲基化程度与SAD发病有明显的相关性，BACE1可能通过甲基化改变基因转录水平，进一步影响淀粉样蛋白β分泌酶的活性，从而导致AD发病。

本研究分析了甲基化水平与年龄的相关性，结果显示BACE1基因(相关系数R=-0.643)启动子区平均甲基化率与年龄之间存在负性线性相关。引起衰老的分子机制至少与两个方面有关,其一是细胞损伤的积累，其二是衰老的相关基因。表观遗传修饰是重要的基因调控手段，其在衰老中起重要作用。随着年龄的增长，基因甲基化程度逐渐降低，而高龄是AD的重要危险因素之一，因此推测DNA甲基化改变可能对AD发病起到一定作用。

基于以上理论和结论，为了进一步阐明BACE1基因启动子区甲基化状态的改变与AD的关系，我们进行了功能学研究。通过基因重组技术，构建了pGL-BACE1质粒。重组质粒转染SH-SY5Y和HeLa细胞24 h后，进行了复甲基化(SAM)、去甲基化(5-aza-CdR)及血清剥夺(降低能量和凋亡)等四种干预处理。荧光素酶报告分析显示，在SY5Y细胞中，BACE1启动子质粒的转录活性在Aβ25-35干预下与非处理组相比增加约20%。说明β淀粉样蛋白可以影响BACE1的表达。在双荧光基因报告中，我们发现在SH-SY5Y细胞中启动子的活性都较HeLa细胞中高，表明BACE1基因的表达具有神经细胞优势性。

SAM是DNA胞嘧啶甲基化的主要供甲基来源。在转移甲基过程中SAM脱甲基变成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH可被水解成HCY。在维生素B12(VitB12)催化下，5-甲基甲氢叶酸盐把甲基递给HCY使其变成蛋氨酸(Met)。Met和三磷酸腺苷(ATP)反应生成SAM，整个甲基循环就完成。AD患者的外周血具有高半胱氨酸、低VitB12和叶酸的特点[21]。我们通过瞬时转染SH-SY5Y和HeLa细胞后的基因检测，结果显示复甲基化试剂SAM可引起BACE1启动子启动活性的改变。这个结果证实了DNA甲基化与基因表达呈负相关。其原因可能由于以下几个方面：直接干扰特异转录因子和各种启动子识别位点的结合；甲基化的DNA结合转录抑制因子引起基因沉默[22]；通过影响核小体的位置或与其染色体蛋白质相互作用而改变染色体的结构，介导转录抑制[23]；甲基化结合蛋白2(mecp2)C端的转录抑制区域(TRD)可以与染色体结合，改变染色质构型，并与组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)等蛋白共同调节基因转录[24]。

研究结果显示，无论是在SH-SY5Y细胞中，还是在HeLa细胞中，每种启动子质粒在血清剥夺和5-aza-CdR干预下的RLA与非处理组相比均无显著性差异，即这些环境因素并没有引起BACE1启动子转录活性的变化。分析原因可能是由于启动子对这些干预因素敏感性较低，以上变化尚不能引起其转录活性的改变；另一方面，也可能由于重组质粒中，BACE1启动子区甲基化率低，5-aza-CdR去甲基化处理不能明显改变甲基化状态，因此不能明显改变转录活性。并且，AD是一种多个环境因素共同作用导致的疾病，单一的一种环境因素尚不能成功模拟AD的病理环境；最后，由于本研究是在体外环境下进行的细胞学功能研究，而在体内各种因素的相互作用才是AD发生的真正环境，这也可能是导致出现以上阴性结果的主要原因。

通过以上的研究，我们发现了BACE1基因甲基化程度的改变与SAD发病有明显相关性。SAM可以通过诱导甲基化抑制基因的转录活性，从而影响淀粉样蛋白分泌酶的活性，进一步导致AD发病。

目前关于阿尔茨海默病表观遗传的研究取得一定的进展[25-27]，但认识还不够，基因启动子区甲基化在AD发生发展中所起的作用尚不清楚。甲基化可能会作为一个很好的分子标志[19]，对SAD的早期筛查，诊断和预测预后均具有重要的临床意义，但尚需进一步的深入研究。