miR-223-3p靶向自噬相关蛋白7调控鼻咽癌细胞自噬

李 伟，胡 县，吴兴宇*

(鄂州市中心医院 1.耳鼻喉科；2.心胸外科，湖北 鄂州436000)

过去十年的流行病学趋势表明，鼻咽癌的发病率逐渐下降，并且该疾病的死亡率也随之大幅下降[1]。但是，对鼻咽癌发病机制的探索和新型药物的开发并不能减缓，甚至忽视。如今，靶向自噬的促死亡和促存活功能已成为治疗鼻咽癌的新型治疗策略[2]。目前，已有多种药物能够诱导人鼻咽癌细胞CNE2自噬性细胞死亡，包括次黄芩素和二芳基喹啉化合物STM-57[3]。miR-223-3p在多种肿瘤中高表达，包括鼻咽癌[4-5]。Yang W等人[6]发现miR-223-3p能够抑制人鼻咽癌细胞的增殖。但是具体机制未明。ATG7是一种关键的自噬中间体，可促进自溶酶体形成、吞噬和清除受损线粒体的自噬作用[7]。本研究旨在探讨miR-223-3p、ATG7与鼻咽癌细胞自噬的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人鼻咽癌细胞CNE2购自上海雅吉生物科技有限公司(货号：ZQ0480)；ATG7，P62，LC3-Ⅱ和TUBULIN抗体购自ABCAM公司(货号：ab133528，ab56416，ab48394，ab7291)；RPMI-1640培养基购自GE health公司(货号：SH30091)；胎牛血清购自Thermo Fisher Scientific公司(货号：10099-133)；pMIR-Report Luciferase质粒购自上海钰博生物科技有限公司(货号：YB-0536)；Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒购自艾美捷公司(货号：K801-200)；PURELINK RNA MICRO KIT购自南京科佰生物科技有限公司(货号：12183016)；miRNA反转录和qPCR试剂盒购自复能基因公司(货号：QP015)；高效RNA转染试剂购自上海康朗生物科技有限公司(货号：KL-D5890)；辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) 购自碧云天生物技术有限公司(货号：A0192，A0208)；ClonExpress II One Step Cloning试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：C112-01/02)；U6荧光定量PCR引物购自复能基因公司(货号：HmiRQP9001)；miR-223-3p荧光定量PCR试剂盒购自HaiGene公司(货号：AP01461)；miR-223-3p序列来自miRBase，miR-223-3p mimics和miR-223-3p inhibitor由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和转染 人鼻咽癌细胞CNE2使用含 10%FBS的RPMI-1640培养基培养，并置于潮湿的环境中(37℃，5%CO2)。使用高效RNA转染试剂进行miR-223-3p mimics或miR-223-3p inhibitor的转染。转染后24小时，收获CNE2细胞并进行下游分析。

1.2.2RNA提取和RT-qPCR 根据试剂盒的说明书，用PURELINK RNA MICRO KIT提取RNA，miRNA反转录和qPCR试剂盒进行miRNA逆转录以及qPCR反应。将所有样品标准化为人U6并表达为倍数诱导。所有反应一式三份进行并重复三次。使用2-ΔΔct方法计算相对表达水平和SD。

1.2.3免疫印迹 将等量的蛋白质(40 μg)在12%SDS-PAGE上电泳，并将条带转移至PVDF膜。将膜用5%脱脂奶粉在0.05M pH 7.4 Tris缓冲盐水(TBS)中封闭3小时，并在4℃下与相应抗体(ATG7，P62，LC3-Ⅱ和TUBULIN)一起孵育过夜。然后在TBST(TBS中的0.1%Tween-20)中将PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)洗涤3次，用时30 min，并与HRP缀合的抗体共同孵育2 h，该抗体为山羊抗小鼠IgA或山羊抗小鼠IgG。用3次TBST(Tris+HCL=Tween)改变洗涤30 min后，最终显影用ECL发光液处理膜5 min，在室温条件下。

1.2.4Luciferase assay 于培养板中接种A549细胞，该培养板为24孔洞型，每孔接种细胞数为5×104个。培养完整1天后，进行转染细胞，混合200 ng/ml双荧光素酶报告质粒和40 nM miR-1254 mimics。在1天的转染后，利用酶标仪检测荧光素酶的活性，通过Luciferase荧光素酶报告检测试剂盒。进行的所有转染均需反复操作大于等于3次以上。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0软件进行数据分析。组间差异应用单因素方差分析。P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR

利用TargetScan软件进行在线分析，发现1处匹配度很高，位于miR-223-3p与TG7的3’UTR，分别处于ATG7 3’端非编码区的2791-2798位置以及1583-1589位置。并且miR-223-3p与ATG7 3’端非编码区的2791-2798位置结合较为保守。见图1。将ATG7的3’非翻译区(3’UTR)的2791-2798位置以及1583-1589位置分别克隆进PMIR-RB-REPORT荧光素酶报告载体，并命名为ATG7 3’UTR-1和ATG7 3’UTR-2。通过Luciferase assay，发现ATG7-3’UTR-1与ATG7 3’UTR-2组在过表达miR-223-3p时，基因活性较处理前显著下降，该基因为荧光素酶报告基因，有统计学差异(P<0.05)。见图2。

图1 miR-223-3p与ATG7的3’UTR匹配位置

图2 miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR

2.2 表达miR-223-3p时，ATG7的表达量下降

表达miR-223-3p后，用该引物进行PCR检测，该微小RNA表达量显著升高(P<0.05)。见图3。免疫印迹发现，ATG7显著下降(P<0.05)；P62显著下降(P<0.05)，而LC3-Ⅱ亦显著下降(P<0.05)，说明过表达miR-223-3p后，CNE2细胞自噬水平下降。见图4。

图3 过表达miR-223-3p

图4 ATG7的表达量下降，细胞自噬标志蛋白显著变化

2.3 敲低miR-223-3p时，ATG7的表达量上升

敲低miR-223-3p后，用miR-223-3p的特异性引物进行实时荧光定量PCR，miR-223-3p的表达量明显下降(P<0.05)。见图5。免疫印迹发现，ATG7显著上升(P<0.05)，P62显著上升(P<0.05)，而LC3-Ⅱ显著上升(P<0.05)，说明过表达miR-223-3p后，CNE2细胞自噬水平上升。见图6。

图5 敲低miR-223-3p

图6 ATG7的表达量上升，细胞自噬标志蛋白显著变化

3 讨论

2012年全世界报告了86500例鼻咽癌，仅占同年所有癌症的0.5%[8-9]。71%的新病例位于亚洲东部和东南部，中南亚[10]。在人口方面，男性患病的可能性是女性的两到三倍，疾病发病的高峰年龄在50到60岁之间[11]。目前相关研究发现miR-223-3p在鼻咽癌肿瘤组织中高表达，能够抑制人鼻咽癌细胞的增殖，但是其具体机制不明。本研究通过分析miR-223-3p、ATG7与鼻咽癌细胞自噬的关系，为治疗鼻咽癌提供理论基础。

ATG7作为巨自噬泛素系统中的核心蛋白，其在自噬和非自噬过程中有着重要的作用[12-13]。miR-223-3p是一种与鼻咽癌细胞周期和凋亡密切相关的miRNA分子，通过影响基因表达来调节细胞周期和凋亡[14]。通过碱基与3’UTR结合，miRNA可以在转录后水平调节基因表达[15]。本研究发现，miR-223-3p靶向ATG7的3’UTR的2791-2798以及1583-1589位置，并且miR-223-3p与1583-1589位置的结合效率更高。最新的研究亦发现miR-223-3p影响各种癌细胞的生物学进展，并在结直肠癌细胞中显示出致癌作用[16]。本研究中，过表达miR-223-3p时，ATG7量下降(P<0.05)，而敲低miR-223-3p后，ATG7量明显上升(P<0.05)。ATG7为胱天蛋白酶-8抑制诱导的自噬死亡所必需的分子。Gong C[17]等发现沉默ATG7基因表达后，能够抑制DTX诱导的自噬。推测细胞中存在miR-223-3p-ATG7-DTX的通路调控细胞自噬，并且受蛋白或核酸分子影响。在本研究中发现，ATG7量与细胞自噬相关蛋白P62和LC3-Ⅱ量明显下降(P<0.05)；ATG7量上升后，细胞自噬相关蛋白P62和LC3-Ⅱ量明显上升(P<0.05)。P62和LC3-Ⅱ作为自噬的标志性蛋白，在自噬体形成中发挥重要作用，表达量的上升表明自噬水平的上升，当ATG7 表达上调后可促进 P62、LC3-Ⅱ的降解[18-19]。

目前，自噬可影响药物敏感性，因此可以作为杀死肿瘤细胞的机制。miR-223-3p能够靶向ATG7 3’UTR的2791-2798和1583-1589位置，并且抑制人鼻咽癌细胞CNE2自噬。基于此，本研究发现的miR-223-3p调控ATG7表达水平的机制可作为肿瘤药物开发的一个新方向。然而本研究并未对其机制进一步研究，后续实验需进行深入分析，为鼻咽癌细胞自噬理论进行补充。