超声提取-高效液相色谱法测定土壤中联苯胺的含量

那晶晶,戴玄吏,徐雪娟,夏飞

(江苏新锐环境监测有限公司,苏州 215000)

联苯胺又名4,4′-二氨基联苯,是染料工业的重要合成中间体,在化工、印染和制药等工业生产中被广泛应用。联苯胺具有高毒性且有强烈的致癌作用[1],含有联苯胺的化工制品在生产过程中会被逐渐释放到环境中,通过环境迁移转移至大气、地表水和土壤中。土壤基质具有吸附作用及物理化学吸收作用,使得联苯胺极易在土壤中富集,其毒性大、难降解的特性对环境和生物造成持久性伤害[2]。随着“土十条”的颁布,土壤污染问题受到政府和民众的广泛关注。对于联苯胺这种危害大、分布广的污染物的检测需求也在日益增加,联苯胺在土壤中往往是微量级的,因此提出一种高效、灵敏的检测手段势在必行。

联苯胺的测定方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[3]、液相色谱法[4]、液相色谱-质谱法[5-6]等,而土壤中联苯胺测定的研究并不多见。文献[7]采用高效液相色谱-三重四极杆质谱法对土壤中联苯胺进行测定,土壤样品经乙酸乙酯超声提取,方法检出限达到0.30μg·kg－1,加标回收率为70.1%～90.4%。文献[2]用加速溶剂萃取(ASE)-凝胶色谱净化-气相色谱-质谱法测定土壤中联苯胺,方法检出限为0.063 mg·kg－1,加标回收率为90.6%～96.1%。2018年12月国家环境保护部发布了土壤中联苯胺测定方法的征求意见稿[8]。在该征求意见稿中,土壤样品经超声提取,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定,方法检出限为2.0μg·kg－1,加标回收率为70.2%～108%。以上方法中液相色谱-质谱法和GC-MS均具有假阳性率低、精密度高等特点,但因仪器昂贵、运行成本高等问题,方法的广泛普及受到一定限制。联苯胺容易在气相色谱进样口发生损失,GC-MS用于低含量联苯胺的测定也并不适用[9]。与以上两种方法相比,高效液相色谱-荧光检测法具有灵敏度高、仪器价格低廉、操作简单等特点,可作为联苯胺检测的一个更好选择。本工作通过前处理方法的优化,超声提取后直接采用高效液相色谱-荧光检测法测定土壤中联苯胺的含量,方法简单、高效、准确,以期为环境监测质量控制与检测提供一定的技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪;HCS5404 型超声波清洗器,功率0.4 k W;HGC-12A 型干式氮吹仪;HPFE 06型高通量加压流体萃取仪;0.22μm 聚四氟乙烯针式过滤器。

联苯胺标准储备溶液:1.0 mg·L－1,用甲醇稀释1 000 mg·L－1联苯胺标准溶液而制得。

1 000 mg·L－1联苯胺标准溶液;氮气纯度不小于99.999%;石英砂(74～150μm);甲醇、丙酮、正己烷、乙腈、氨水为色谱纯;五水合硫代硫酸钠为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

ZORBAX C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为体积比25∶75的乙腈-0.01 mol·L－1乙酸铵溶液的混合液,等度洗脱;流量1.0 mL·min－1;柱温40 ℃;激发波长292 nm,检测波长395 nm;进样体积10.0μL。

1.3 试验方法

土壤样品经自然干燥或冷冻干燥后,称取5.00 g置于40 mL棕色螺口玻璃瓶中,瓶口垫片为聚四氟乙烯材质,加入10 mL 含有1%(体积分数,下同)氨水和50 mg·L－1硫代硫酸钠的甲醇溶液(作为提取剂)旋紧瓶口,于涡旋振荡器中将土壤样品振荡松散。超声提取30 min,加冰保持温度低于10 ℃,静置10 min,取上清液2.0 mL,经0.22μm聚四氟乙烯针式过滤器过滤后直接按照仪器工作条件分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

在高效液相色谱中流动相的选择是十分重要的,合适的流动相可增加检测的灵敏度和分辨率。试验首先选择甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系进行分析,结果发现,在甲醇-水流动相体系中,联苯胺峰形较差,峰展宽严重,而在同样比例的乙腈-水流动相体系中,联苯胺峰形有所改善,但仍然存在拖尾现象。考虑到联苯胺的极性和离子化,其在C18反相色谱柱上容易发生拖尾的现象,须在流动相中添加缓冲盐以抑制联苯胺的离子化,增加联苯胺在色谱柱上的保留能力。试验选择将乙酸铵添加至乙腈-水流动相体系中,结果表明在流动相体系中添加缓冲盐,联苯胺的峰形尖锐、对称,柱效高。不同流动相体系中联苯胺的色谱图见图1。经优化后,试验最终确定以体积比25∶75 的乙腈-0.01 mol·L－1乙酸铵溶液的混合液作为流动相。

图1 不同流动相体系中联苯胺的色谱图Fig.1 Chromatograms of benzidine in different mobile phase systems

2.2 提取方式的选择

通过查阅文件资料发现,土壤中联苯胺的提取常采用超声提取和ASE 这两种方式[2,7-8]。试验分别用ASE和超声提取法对空白石英砂样品进行提取,提取剂分别选择体积比1∶1的正己烷-丙酮混合液和甲醇。ASE提取温度为80 ℃,收集提取液,氮吹浓缩至1 mL,须将体积比1∶1的正己烷-丙酮混合液的提取剂置换成甲醇后定容至1 mL,提取液经过滤后上机测定;超声提取时,水温控制在10 ℃以下,加入提取剂甲醇20 mL,超声30 min后静置过滤,收集上层提取剂,重复提取2次,合并提取剂浓缩至1 mL,同理,若提取剂为体积比1∶1的正己烷-丙酮混合液时,须将其置换成甲醇,提取液经过滤后上机测定。试验考察了提取方式对联苯胺回收率的影响,结果见图2。

图2 提取方式对联苯胺回收率的影响Fig.2 Effect of extraction method on recovery of benzidine

由图2可知,在使用相同提取剂的条件下,超声提取的提取效率均要高于ASE的提取效率,原因是ASE提取时需要加热,而联苯胺不稳定,不适合在加热条件下提取。另外,ASE 仪器和耗材价格均较贵,运行成本高,而超声设备价格低廉,操作简单。甲醇作为提取剂不需要进行溶剂置换,减少了一步浓缩过程,回收率要高于体积比1∶1的正己烷-丙酮混合液。因此,试验选择以甲醇为提取剂,超声提取土壤中联苯胺。

2.3 超声提取步骤的优化

为进一步提高联苯胺的回收率,寻找影响回收率的关键步骤,分别对空白瓶、石英砂和土壤进行加标试验,提取方式见上述2.2节超声提取,提取剂为甲醇。考察了在不同基质和浓缩方式下超声提取联苯胺的回收率情况,结果见表1。

表1 不同基质和浓缩方式下超声提取联苯胺的回收率Tab.1 Recovery of benzidine by ultrasonic extraction under different matrices and concentration methods

由表1 可知,在相同的浓缩方式(氮吹,水浴60 ℃)下,空白瓶中的回收率高于石英砂和土壤基质的样品,说明回收率的损失一部分来自于固体基质的吸附和提取剂提取能力的影响。空白瓶中没有固体基质,回收率依旧不高,说明回收率的损失有一部分来自于浓缩定容过程。通过观察加标样品的液相色谱图发现,相较于联苯胺的标准色谱图,加标样品的目标峰右侧多出一个不明物质峰。因联苯胺具有不稳定性,易被氧化成醌类化合物,加热条件下可能会加剧这种反应,该峰可能为联苯胺氧化后的产物。为验证这一假设,试验在氮吹环节去除加热过程,同时保持超声提取温度在10 ℃以下,对空白瓶的加标样品进行测定,结果发现目标峰右侧的峰消失,并且回收率上升至60.0%以上。上述结果表明,在联苯胺的提取过程中,氮吹和水浴加热过程是联苯胺损失的最主要环节,通过不加热方式进行氮吹虽然能升高回收率,但是处理时间过长。综合以上考虑,试验对提取步骤进行调整,取消浓缩步骤,土壤样品经干燥后,加入10 mL 甲醇超声提取,提取液经过滤后直接上机测定,加标回收率达到了70.0%以上。

2.4 提取剂的选择

提取剂是影响提取效率的一个重要因素,试验比较了甲醇、甲醇-氨水、甲醇-氨水-硫代硫酸钠这3种提取剂的提取效果。结果表明:添加氨水的甲醇溶液(甲醇-氨水)提取效率更好,提取效率在80.0%以上;硫代硫酸钠的加入并不会影响提取效率,而且能够防止联苯胺的氧化。试验进一步调节了提取剂中氨水比例,考察了含体积分数分别为1%,3%,5%的氨水的甲醇溶液的提取效果,结果表明提高氨水的比例并没有提高提取效率。因此,试验最终选择含有1%氨水和50 mg·L－1硫代硫酸钠的甲醇溶液作为土壤中联苯胺的提取剂。

2.5 标准曲线和检出限

用甲醇逐级稀释1.0 mg·L－1的联苯胺标准溶液,配制成质量浓度为0.50,2.00,5.00,10.0,50.0μg·L－1的联苯胺标准溶液系列。按仪器工作条件进行测定,以目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,联苯胺标准曲线的线性范围为0.50～50.0μg·L－1,线性回归方程为y＝5.090×10－1x－1.314×10－1,相关系数为0.999 8。

对空白石英砂加标样品平行测定7次,加标量为1.00μg·kg－1,根据HJ 168－2010《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》计算方法的检出限和测定下限。本方法中联苯胺的检出限为0.20μg·kg－1,测定下限为0.80μg·kg－1。

2.6 精密度和回收试验

对空白土壤样品进行1.00,10.0,80.0μg·kg－1等3个浓度水平的加标试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2 可知,土壤样品的加标回收率为75.9%～99.1%,RSD 均小于4.0%,说明该方法的精密度和准确度能够满足土壤环境监测的需求。

2.7 样品分析

按照试验方法对苏州市土壤和沉积物样品中的联苯胺进行测定,结果表明,样品中均未检出联苯胺。

本工作采用超声提取-高效液相色谱法测定土壤中联苯胺的含量,对仪器方法和前处理条件进行优化和改进,有效减少了前处理步骤,提高了提取效率。方法简单高效,灵敏度高,检出限达到了0.20μg·kg－1,相较于文献方法和征求意见稿[2,7-8],本方法的检出限处于较低水平,能够满足土壤中微量联苯胺的测定要求,同时高效液相色谱仪相对低廉的价格也利于方法的推广。