牛肉红朱橘与惠水金钱橘的花粉形态和育性差异

2022-04-24王小柯郑乾明李文云

农技服务 2022年3期

王小柯, 罗怿, 林乾, 郑乾明, 解璞, 李文云

（贵州省果树科学研究所，贵州贵阳 550006）

惠水金钱橘（朱红橘）是柑橘属宽皮柑橘中的朱橘类，果实较小，果皮油胞明显，结果率较高，易剥皮，主要分布于贵州省惠水县，已有300 多年的栽培历史，是地方传统柑橘品种［1］。惠水金钱橘历来沿用实生繁殖，1992年选育者从当地农民实生繁殖培育的金钱橘植株中遴选出1株优良变异单株，经多年试验示范，表现较好，2011年通过贵州省农作物品种审定委员会审定，正式命名为“牛肉红朱橘”［2］。该品种果皮红如牛肉色，果肉呈暗红色，剥皮时橘香浓郁，留香时间长，果肉脆嫩，风味独特，酸甜适口［3］，种子数较少或无种子。对牛肉红朱橘及其亲本的花器官结构及花粉育性开展研究，分析牛肉红朱橘种子少核或无核现象的原因，同时从花粉形态方面比较二者的差异，为其在孢粉学上的鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为15年生牛肉红朱橘和惠水金钱橘植株，砧木为枳壳，种植于贵州省黔南州惠水县烂坝林场，该地区属亚热带季风湿润气候，果园海拔949.7 m，果园年均温15.8℃。

1.2 方法

1.2.1 花粉粒形态观察选择盛花期健壮植株，采集树冠外围中上部含苞待放的花蕾，用消过毒的镊子去掉花瓣和花萼，只留花药。将采集的花药迅速投入电镜固定液中，室温固定2 h，再转移至4℃保存。固定好的样品经0.1 mol/L 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min；用0.1 mol/L 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）配制的1%锇酸室温避光固定1～2 h；用0.1 mol/L 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。样本依次浸泡30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精，每次15 min，之后用乙酸异戊酯浸泡15 min。将样本放入二氧化碳临界点干燥仪（Quorum，型号：K850）内干燥（将CO2通入临界点干燥仪，保持15 min，之后置换3～5 次，升温至临界温度（35℃），然后放气即可）。将干燥后的样本紧贴于导电碳膜双面胶上，放入离子溅射仪（HITACHI，型号：MC1000）样品台上喷金30 s 左右。在扫描电子显微镜（HITACHI，型号：SU8100）下观察。

计数：选择较为典型的清晰视野进行观察，并拍照保存。分别在300 倍观察花粉整体效果、3 500 倍观察花粉赤道面和极面、12 000 倍下观察花粉外壁纹饰特征，并测量赤道轴长（E）、极轴长（P）、网孔直径（D）和网脊宽度（W）。

花粉描述：参考叶荫民等［4-6］的方法，对牛肉红朱橘和惠水金钱橘的花粉进行描述，P＜25 μm 为小型花粉，25 μm＜P＜50 μm 为中型花粉，50 μm＜P＜100 μm 为大型花粉。花粉形状以P/E 表示，其中0.88＜P/E＜1.14 为圆球形，1.14＜P/E＜1.33 为近长球形，1.33＜P/E＜2 为长球形，P/E＞2 为超长球形。每个品种随机选取20粒花粉粒进行相关数据的测量和统计，用SPSS 软件计算平均值和标准差。

1.2.2 花器官结构及花粉育性观察取正常发育的花朵观察形态结构。将花药置于28℃恒温培养箱，待其爆出花粉，收集花粉置于干燥离心管中密封。用毛笔蘸取花粉抖落在载玻片上，滴加醋酸洋红染液，混合均匀后盖上盖玻片，染色20 min，用滤纸从边缘吸干多余染液，置于显微镜下观察，每个品种统计1 000 个以上花粉粒，计算被染成红色的花粉占整个花粉数的百分比。

将培养基（0.8% 琼脂＋16% 蔗糖＋10 mg/L 硼酸）滴在载玻片上，冷却后用毛笔蘸取花粉抖落在培养基上，将载玻片放入带有湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子，置于26～28℃培养24 h，显微镜下观察萌发率，以花粉管长度超过花粉直径为花粉发芽的标志，每个品种5个重复，每个重复选取10个视野。

2 结果与分析

2.1 花粉形态

从表1、图1 看出，牛肉红朱橘和惠水金钱橘的花粉形态相差不大，牛肉红朱橘的花粉粒略大于惠水金钱橘。牛肉红朱橘的花粉以单粒形式存在，花粉粒较小，圆球形，极面观为四裂圆形，赤道面观为长圆形，极轴长21.13 μm，赤道轴长23.73 μm，极轴长/赤道轴长为0.89。惠水金钱橘的以单粒形式存在，花粉较小，圆球形，极面观为四裂圆形，赤道面观为长圆形，极轴长20.91 μm，赤道轴长22.09 μm，极轴长/赤道轴长为0.95。

图1 牛肉红朱橘和惠水金钱橘花粉形态扫描电镜观察结果

表1 牛肉红朱橘和惠水金钱橘的花粉形态特征

牛肉红朱橘和惠水金钱橘花粉外壁均属于网状纹饰，即由凸起的网脊和网眼组成，牛肉红朱橘网眼直径0.34 μm，网脊宽0.71 μm。惠水金钱橘的网眼直径0.34 μm，网脊宽0.77 μm。二者网眼大小相差不大，网眼成浅穴状或兼具不规则小穿孔，网眼数量较稀疏，一般为圆形或椭圆形，分布不均匀，网脊宽度牛肉红朱橘稍小。二者的萌发器官均为孔沟类型，即花粉壁表面同时存在沟和孔，具有被子植物的典型特征。孔沟均为4个，均沿极轴方向等距离环状分布。

2.2 花器官结构及花粉育性

牛肉红朱橘和惠水金钱橘的花器发育正常（图2），开花时雌、雄蕊已成熟。花瓣均呈乳白色，多为5 瓣，花萼杯状，浅绿色，雄蕊平均19～22 枚，雄蕊和柱头的长度关系满足正常自然授粉的条件。

图2 惠水金钱橘（左）和牛肉红朱橘（右）花器官结构

醋酸洋红染色法染色20 min后的染色情况见图3，离体花粉固体培养基培养24 h后的萌发情况见图4。从表2 看出，牛肉红朱橘、惠水金钱橘花粉染色率分别为93.95%和95.45%，二者花粉活力均较高且没有明显差异；花粉离体萌发率分别为71.25% 和54.62%，牛肉红朱橘的花粉离体萌发率明显高于惠水金钱橘。

图3 牛肉红朱橘（左）和惠水金钱橘（右）花粉染色情况

表2 花粉醋酸洋红染色法染色率与花粉离体萌发率

3 讨论

花粉的形态特征受基因控制，具有极强的遗传保守性，其中包含着大量信息，可为植物的系统分类提供依据［7-8］。有研究表明，根据果树花粉形态特征差异，可对果树进行种和品种的分类以及鉴别［9-10］，琯溪蜜柚和红肉蜜柚的花粉形态和花粉外壁纹饰比较一致，表明亲缘性较近［11］。果实色泽品质差异受环境的影响较大，彭志军等［12］通过AFLP 技术从DNA 水平上揭示野生型（金钱橘）与变异体（牛肉红）的差异。本研究从花粉形态学方面比较牛肉红朱橘及其亲本惠水金钱橘的差异，结果显示，二者花粉形状和外壁纹饰差异不大，验证了二者的亲缘关系较近。

叶荫民等［4］对金柑属、枳属和柑橘属20个品种的花粉观察发现，柑橘花粉以长圆球形和近长球形为主，大部分有4条孔沟，其中，朱橘花粉较小，网眼小，脊宽，萌发孔两端小。武晓晓等［13］利用扫描电镜对不同种属柑橘花粉形态结构进行扫描观察发现，宽皮柑橘花粉形状主要为近长球形，大部分有4 条孔沟，外壁为网状纹饰或细网状纹饰，网脊普遍较宽。牛肉红朱橘和惠水金钱橘的花粉粒以单粒形式存在，较小，形状为圆球形，外壁为网状纹饰，网脊宽，网眼小并呈陷点状，萌发沟4条，狭缝状且中部扩大，与上述研究结果基本吻合。

花粉败育是某些柑橘品种单性结实的原因，也是致使某些柑橘品种产量降低的重要因素，研究花粉育性对柑橘生产和育种工作具有重要意义［14-17］。周之珞等［16］对建阳桔柚的花器官构造、花粉育性授粉后花粉的萌发生长特性及胚胎早期发育规律研究发现，花粉育性较低可能是建阳桔柚无核或少核的原因之一。余杨等［17］从花粉育性、成熟胚囊结构以及胚胎发育情况等方面对南丰蜜橘无核成因分析发现，南丰蜜橘花粉育性不高是其无核现象的原因之一，胚胎早期败育是导致南丰蜜橘无核的主要原因。牛肉红朱橘花器官完整，雄蕊和柱头长度无明显差异，花粉体外萌发率为71.25%，花粉活力较高，达93.95%，可育性高，据此推断花粉育性与果实少核或无核现象之间的关系不甚紧密。因此，仍需对其胚囊结构和胚胎发育情况进行观察与分析，以便进一步探究少核或无核现象产生的原因。