七曜山海拔高度对百合中薯蓣皂苷含量的影响

龚伟，王梦禅*，游静，陈联军

（1.重庆三峡医药高等专科学校；2.重庆三峡抗肿瘤天然药物工程技术研究中心; 3.重庆安全技术职业学院，4.万州区新达百合种植专业合作社，重庆万州 404120）

本品为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb、百 合Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.干燥肉质鳞叶，可食用也可入药[1]。百合在我国大部分地区均有分布，其中以江苏、湖南、重庆、四川、甘肃、陕西等地为主要分布区域，其中与重庆毗邻的湖北利川市七曜山区域也有百合分布[2]。药用百合含有多种药效活性成分，主要有多糖、皂苷、生物碱、酚类以及黄酮类化合物等[3-5]。百合中的皂苷是百合的主要生物活性物质之一，中医认为百合性味甘寒，有清心安神、养阴润肺的功效，常用于治疗虚烦惊悸、阴虚久咳、失眠多梦等症状。现代研究表明，百合中的皂苷具有一定的抗抑郁[6]和抗肿瘤活性[7]。由于百合中皂苷的药理作用显著，故成为中药百合质量评价指标之一。

据报道，百合的不同施肥措施和产地差异对百合中皂苷含量有一定的影响，不同的气候因素[8]、不同的生长年限[9]、不同品种百合[10]的皂苷含量也有一定的差异，但不同海拔高度对百合中皂苷含量的影响未见系统报道。百合种植地域分布广，海拔差异大，本文主要探讨三峡中药材生产区七曜山区域百合中皂苷含量随海拔高度变化的趋势，为百合适宜栽培区域的选择提供科学依据。百合中皂苷种类较多，而皂苷类物质的检测常以薯蓣皂苷为检测指标[11-13]，故本实验主要通过测定薯蓣皂苷的量来反映百合中皂苷的含量情况。

一、材料与仪器

（一）材料

卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.），采自七曜山区域重庆市万州区恒合乡（H298，H515，H673，H834，H983，H1134）和湖北省利川市谋道镇（M1246，M1355，M1432）两个地区（数字为海拔高度），两地区相邻，土壤环境和气候条件相似。采摘样品经重庆三峡中药研究所付绍智教授鉴定，均为卷丹百合。样品剥去肉质鳞叶后，经沸水微烫后烘干备用。薯蓣皂苷对照品（中国食品药品检定研究院）、甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇、石油醚、正丁醇为分析纯，水为超纯水。

（二）仪器

高效液相色谱仪（安捷伦1260），蒸发光散射检测器（Agilent 1260 Infinity），GZX-101电热鼓风干燥箱（上海圣科仪器设备有限公司），S11-4数显恒温水浴锅（上海博讯），FA1004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），RE-25B旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司），FE130型粉碎机，药典筛。

二、方法

（一）色谱条件

使用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-0.2%甲酸水溶液（55∶45）为流动相；流速为1 mL/min；柱温为30℃；蒸发光散色检测器漂移管温度为46℃，载气（N2）流速1.6 L/min，通过对标准品和样品的检测，得到色谱图见图1和图2。

图1 标准品HPLC图谱

图2 样品HPLC图谱

（二）样品溶液制备[14-15]

样品经粉碎机粉碎后，过40目药典筛，所得百合粉末在烘箱中经50℃烘干至恒重，精密称定百合粉末30 g至圆底烧瓶，加入80%的乙醇200 mL，在70℃水浴下加热回流3 h，回流提取2次，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，并减压浓缩至干，将浓缩后的干残渣溶于40 mL水中，再用等体积石油醚萃取3次，弃去石油醚，水层再用等体积水饱和正丁醇萃取4次，合并回收正丁醇，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，浓缩残渣用适量甲醇溶解后，移入容量瓶定容至5 mL，作为样品溶液备用。

（三）对照品溶液制备

精密称取薯蓣皂苷对照品约10 mg，加甲醇溶解后，移入容量瓶定容至10 mL，制成1.08 mg/mL的对照品溶液。

（四）薯蓣皂苷标准曲线

精密量取薯蓣皂苷对照品各0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度。在上述色谱条件下各进样20μL，测定峰面积值，以峰面积和浓度值进行回归处理，得回归方程：y=0.173 4x+0.055 8，r=0.999 6。结果表明，薯蓣皂苷浓度在0.108～0.864 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

（五）精密度实验

取同一对照品溶液进行实验，每次进样20μL，连续进样6次，测定薯蓣皂苷峰面积值，峰面积稳定，RSD为1.2%。

（六）稳定性实验

取同一样品溶液进行实验（产自重庆市万州区恒合乡，批号为H983），每次进样20μL，分别在0，2，4，6，8，12 h各进一针，测定皂苷峰面积值，得到的峰面积稳定，其RSD为1.5%。

（七）重复性试验

取同一批号样品（产自湖北利川谋道镇，批号为M1355）5份，按（二）样品溶液制备方法制备供试品溶液，按（一）色谱条件，每次进样20 μL测定皂苷峰面积值，计算薯蓣皂苷含量为5.4 μg/g，RSD为1.4%。

（八）加样回收实验

取薯蓣皂苷含量为5.4 μg/g的药材粉末（产自湖北利川谋道镇，批号为M1355）6份，经50℃烘干至恒重，各精密称定约5 g，置具塞锥形瓶中，再加入相当于样品中薯蓣皂苷含量的80%、100% 和120%的薯蓣皂苷对照品溶液，按（二）样品溶液制备方法制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪测定皂苷峰面积值，计算薯蓣皂苷含量，得到回收率为98.82%，RSD为1.8%。

（九）样品含量测定

取采集的9个百合样品药材，按照操作制备样品溶液，在图1和图2色谱条件下进样20 μL，测定峰面积并计算薯蓣皂苷含量，结果见表1。

表1 百合中薯蓣皂苷含量

由表1可以看出，海拔300 m左右时薯蓣皂苷含量只有3.85 μg/g，在所有样品中含量最低，海拔高度升高到500～700 m时，薯蓣皂苷含量较300 m时有明显变化，升高到4.72μg/g，随着海拔高度的进一步升高，到达到800 m以上时，薯蓣皂苷含量上升到了5.2 μg/g以上，但在这一阶段并不是海拔越高，薯蓣皂苷含量就越高，海拔800～1250 m范围内，薯蓣皂苷的含量并没有很大的变化，其中海拔1000 m左右时薯蓣皂苷含量最高，海拔高度上升到1300 m后薯蓣皂苷含量降至5.27 μg/g，1400 m后降至5.21 μg/g。

三、结果

（一）薯蓣皂苷的提取

旋转了不同比例的乙醇溶液在不同温度下回流提取百合中的薯蓣皂苷，发现80%的乙醇提取效果最好，温度对提取的影响相对较低，70℃温度不会过高，同时又能保证乙醇回流速度，缩短提取时间。

（二）流动相的选择

选择了乙腈-水（45∶55）、乙腈-水（55∶45）、乙腈-水（65∶35）、乙腈-0.2% 甲酸（45∶55）、乙腈-0.2%甲酸（55∶45）和乙腈-0.2%甲酸（65∶35）6种流动相进行比较，从整体来看，乙腈-水溶液的洗脱效果不如乙腈-0.2%甲酸溶液，乙腈-0.2% 甲酸溶液中，乙腈-0.2%甲酸（55∶45）流动相的洗脱分离效果最好。

（三）ELSD检测参数设定

比较了蒸发光散色检测器在不同漂移管温度和氮气流量下峰面积的大小、基线漂移和噪声情况，发现在漂移管温度46℃，载气（N2）流速1.6 L/min条件下，峰形较好，噪声较低。

（四）百合中薯蓣皂苷含量测定

在三峡库区七曜山区域，海拔800 m以下时，卷丹百合中薯蓣皂苷含量随海拔高度升高而升高，在海拔800～1250 m范围内，薯蓣皂苷含量较高，海拔高度上升到1300 m后薯蓣皂苷含量有下降趋势，但下降幅度不大。由此可见，海拔800～1250 m范围适宜卷丹百合总薯蓣皂苷的积累。

四、讨论

从实验结果看，在三峡库区七曜山区域海拔800～1250 m范围内，薯蓣皂苷含量较高，适宜发展药食两用卷丹百合的生产，但由于七曜山区域海拔高度限制，更高海拔对百合中皂苷含量的影响并未研究。同时，评价百合质量的指标不仅只有皂苷含量，故本项试验对周边的川渝地区和鄂西地区的卷丹百合的基地建设选址有一定的借鉴意义，但不能凭本指标选址。