毒胡萝卜素诱导PC12 细胞凋亡的实验研究

严 利，黄赛玉

（湘潭医卫职业技术学院临床学院，湖南 湘潭 411101）

凋亡（apoptosis）是缺血后神经元死亡的一种重要形式，凋亡信号途径包括外源性途径、内源性途径和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途径[1，2]，其中前二者为经典凋亡途径，ERS 为近年来发现的一种新的凋亡途径[3]。毒胡萝卜素（Thapsigargin，TG）是一种不可逆性内质网钙离子ATP 酶抑制剂，可诱导内质网应激，而应激的持续存在将导致细胞凋亡[4]。目前，脑缺血后神经元凋亡的发生机制尚未明确，仍有待进一步研究。本研究主要探讨毒胡萝卜素诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的凋亡机制，以期为缺血后神经元凋亡的防治提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12 细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所；1640 培养基（Hyclone），胎牛血清和胰酶消化液（Gibco），青-链霉素溶液（碧云天），Thapsigargin 和MTT（Sigma），JNK3 和GM130（Proteintech），Caspase-3（CST），Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡（长沙维尔生物有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒（Wellbio），HRP goat anti-mouse IgG（Proteintech），HRP goat anti-rabbit IgG（Proteintech），Super ECL Plus 超敏发光液（Thermo pierce），显影液和定影液（WellBiology）。

1.2 细胞培养 PC12 细胞在含10%的胎牛血清、1%青-链霉素双抗的RPMI-1640 培养基中进行培养，培养装置为5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱，隔天换液，取细胞形态良好、对数生长期的细胞进行实验。

1.3 药物浓度及实验分组 1 mg 装的Thapsigargin 溶于1 ml DMSO 溶液中，储液浓度为1 mg/ml。取1 μl加入到10 ml 完全培养基中，终浓度为0.1 μg/ml。PC12 细胞分别经正常情况下培养5 h（正常组）和加入浓度为0.1 μg/ml的Thapsigargin 处理5 h（Thapsigargin 组）进行以下实验。

1.4 方法

1.4.1 MTT 法检测 两组设3 个复孔，处理5 h 后，每孔加入25 μl 溶解于DMEM的MTT 溶液（5 mg/ml），在培养箱中孵育4 h，弃掉培养液，加入150 μl DMSO 溶液，37 ℃摇床低速振荡10 min，用酶标仪检测细胞在490 nm 处的吸光度（A）值，计算出PC12 细胞的存活率。

1.4.2 Annexin V-FITC/PI 双染法检测 PC12 细胞凋亡率严格按照Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡试剂盒（货号：KGA108）的说明书检测PC12 细胞凋亡率。用不含EDTA的胰蛋白酶进行消化，以冰冷的PBS 洗涤2 次，离心（2000 rpm/min，5 min）后收集细胞，收集（1～5）×105细胞。除去上清液，滴入500 μl Binding buffer 悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI 使用液使其混匀，置于室温下避光5～15 min 后，1 h 内采用流式细胞仪检测其荧光强度。

1.4.3 Western blot 蛋白印迹法检测 收集两组PC12细胞，提取总蛋白，使用蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按每孔上样量50 μg 进行SDS-PAGE 电泳，恒流冰浴电转至PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入相应一抗，抗JNK3（1∶500）、Caspase-3（1∶1000）和β-actin（1∶4000），4 ℃孵育过夜。用TBST 洗3 次，每次10 min。加入相应二抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗4 次，ECL 显影和采图。β-actin 为内参，利用Quantity one 软件将目标条带与β-actin 条带吸光度值之比调为其蛋白表达水平的相对值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计软件对数据分析，计量资料以（）表示，比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC12 细胞的形态观察 PC12 细胞的形态呈圆形或锥形，贴壁不稳，易成团，胞间有突起相互连接，细胞折光性好，可见胞核，细胞状态稳定后生长速度快，成簇生长，见图1。

图1 显微镜观察正常培养条件下PC12 细胞的形态及结构（10×40）

2.2 Thapsigargin 对PC12 细胞存活率的影响 经0.1 μg/ml Thapsigargin 处理5 h的PC12 细胞存活率较正常培养的细胞明显减少。Thapsigargin 组吸光度A 值为（0.1497±0.0357），低于正常组的（0.2573±0.0093），差异有统计学意义（t=5.0490，P=0.0070）。

2.3 Thapsigargin 对PC12 细胞凋亡率的影响 正常组PC12 细胞绝大部分均为双阴性细胞，细胞结构完整，无明显细胞凋亡或死亡，而经Thapsigargin 处理后PC12 细胞的凋亡率明显增加，见图2。Thapsigargin 组早期凋亡率及总凋亡率高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组PC12 细胞凋亡率比较（，%）

表1 两组PC12 细胞凋亡率比较（，%）

图2 AnnexinV-FITC/PI 法检测PC12 细胞的凋亡率流式细胞分析图

2.4 Thapsigargin 对PC12 细胞JNK3、Caspase-3 蛋白表达的影响 Thapsigargin 组JNK3、Caspase-3 蛋白表达高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组JNK3、Caspase-3 蛋白表达比较（）

表2 两组JNK3、Caspase-3 蛋白表达比较（）

3 讨论

随着人口老龄化的加剧及卒中危险因素的不断增多，脑卒中发病率逐年上升。脑卒中作为神经系统常见病、多发病，具有高复发率、高致死率、高致残率的特点，目前已经成为全世界成人中第2 死亡原因和第1 致残原因[5，6]，其存活者中有50%～70%的患者会遗留严重残疾，给家庭和社会带来巨大的压力和沉重的经济负担[7]。卒中类型以缺血性卒中最常见，约占全部卒中类型的80%。脑缺血是由于血栓或栓子阻塞脑内动脉而导致血管闭塞，引起脑组织缺血缺氧、神经元受损的一系列临床症状和体征[8]。缺血后神经元的凋亡发生是一种多环节调控过程，包括兴奋氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、热休克蛋白表达受阻及血脑屏障破坏等过程[9，10]。内质网作为细胞凋亡途径的调节器越来越受到重视。研究表明[11]，Thapsigargin 可抑制内质网钙泵功能，诱导内质网中储藏钙的释放，增加胞质中Ca2+浓度，导致Ca2+环境失衡，引起神经元凋亡。本研究中利用Thapsigargin诱导PC12 细胞，建立缺血后神经元损伤模型，通过MTT 法检测存活率和Annexin V-FITC/PI 法检测凋亡率，结果显示Thapsigargin 组早期凋亡率及总凋亡率高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示经Thapsigargin 组处理后PC12 细胞的存活率较正常组明显减少，凋亡率较正常组明显增加。

JNK 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族中的重要成员，主要参与细胞存活与凋亡、增殖与分化等多个生物学过程。JNK 主要包括JNK1、JNK2、JNK3 3 个成员，其中JNK3 是JNK 信号通路中非常重要的异构体之一，主要分布在中枢神经脑组织中，与神经元的凋亡关系密切[12，13]。大量的炎性介质、细胞因子、应激可以激活JNK3及其后的信号转导，有研究表明[14]，帕金森病患者中JNK3 磷酸化可导致神经元损伤。此外，JNK3 可介导百草枯和鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元死亡[15]。JNK3 还可启动Bcl-2、Caspase-3 等信号，介导神经细胞凋亡[16]。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）为细胞凋亡途径中的重要因子，在调节细胞凋亡过程中具有重要意义[17]。帕金森病动物实验中发现[18]，脑细胞发生凋亡形态改变，其中有Caspase-3 被激活。Zhang Y 等[19]研究表明，在肌萎缩性脊髓侧索硬化症动物模型中，Caspase-1 和Caspase-3 被激活，同时发现Caspase-1 和Caspase-3的mRNA 表达水平明显增加。王丽晶等[20]在脑卒中相关性肌萎缩实验模型中发现，抑制Caspase-3 通路激活，可抑制肌细胞凋亡，增加肌纤维横截面积，对抗脑卒中相关性肌萎缩。本研究中Thapsigargin 组JNK3、Caspase-3 蛋白表达高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示JNK3、Caspase-3 可能参与了神经细胞损伤过程。Caspase-3 作为脑缺血损伤中发生神经细胞凋亡的一个关键酶以及执行者，抑制Caspase-3的活性，可在一定程度上减缓或阻止缺血性脑卒中的进程。

综上所述，经Thapsigargin 处理后PC12 细胞凋亡率增加，JNK3、Caspase-3 蛋白表达增加，推测Thapsigargin 诱导的神经元内质网应激中，可通过激活JNK3及其后的信号通路，促进Caspase-3 表达，介导神经细胞凋亡。