甘草提取液对心肌缺血小鼠氧化应激的调节作用研究

杨 雁，宋艳萍，杨 彤，马 龙，王泽龙，李良同，何 颖

（吉林农业科技学院中药学院，吉林 吉林 132109）

心血管疾病特别是缺血性心脏病，已成为影响社会所 有经济群体的世界性健康问题。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是缺血性心脏病的常见表现，是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。心肌缺血时，血氧供需失衡，即可发生AMI，导致心肌细胞坏死[1]。心肌缺血期间会产生大量活性氧（ROS），导致心肌功能障碍和坏死。因此，具有抗氧化或自由基清除活性的治疗干预可应用于对抗缺血性心脏病中的氧化应激[2]。近年来，越来越多的研究表明，中草药具有一定的抗氧化作用，人们对中草药的接受度越来越高[3]。甘草的主要成分为甘草素、三萜皂苷、异黄酮、香豆素和黄酮等。甘草素主要存在于甘草的根中，具有多种药理及生化特性，如抗氧化、抗癌、抗炎、保肝等[4-7]。本试验建立心肌缺血模型，研究甘草提取液对心肌的保护作用，为甘草提取液对心肌缺血小鼠氧化应激的调节作用的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

50 只SPF 级KM 小鼠，雌、雄各半，（20±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。试验期间小鼠常规饲养，室温18～25 ℃，自由饮水。

1.1.2 试剂与仪器

主要试剂：甘草饮片（河北全泰药业有限公司，批号：2103001）；75%乙醇、0.9%氯化钠溶液、盐酸肾上腺素注射液（上海全宇生物科技动物药业有限公司）；1%TTC（北京雷根技术生物有限公司）；肌酸肌酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

主要仪器：L-600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；3K15 Sigma 高速离心机、Tecan Infinite 200 Pro 多功能酶标仪（特肯有限公司）；SB-5200DT 超声波清洗机（宁波新艺超声设备有限公司）；752 紫外可见分光光度计（上海奥普勒仪器有限公司）；BS-1E恒温振荡培养箱（良友仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

50只小鼠随机分为空白对照组、对照组以及高、中、低剂量组（剂量分别为220、150、80 mg/kg），每组10 只小鼠。连续灌胃给药21 d，空白对照组及对照组小鼠给予等剂量生理盐水；第19～21 d给药30 min后，对照组及高、中、低剂量组小鼠腹腔注射6 mg/kg 异丙肾上腺素，构建急性心肌缺血模型（空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水）。

1.2.2 甘草提取液的制备

取0.50 g 过60 目筛的甘草粉末，加入50 mL 70%乙醇，60 ℃超声提取30 min，过滤，3 500 r/min 离心10 min，蒸发回收大部分溶剂，于50 mL容量瓶定容。

1.2.3 TTC法测定小鼠心肌梗死面积

小鼠心肌梗死，冷PBS 冲洗干净心脏。心脏急速冷冻，切成数片厚度为1～2 mm 的小薄片，加入1% TTC 染液，37 ℃水浴避光反应15～30 min。反应完成可见非梗死区域呈砖红色，梗死区域呈灰白色。固定焦距拍照，采用平面面积求积法计算梗死面积，以坏死面积与占总面积的百分比衡量心肌梗死程度。

1.2.4 比色法测定血清CK及LDH活性

CK活性：造模结束每组小鼠眼球取血，按试剂盒要求操作，45 ℃水浴15 min，双蒸水调零，660 nm 处1 cm 光径比色，测各管的吸光度值。

LDH 活性：造模结束每组小鼠眼球取血，肝素抗凝取血浆，按照试剂盒要求操作，室温放置3 min，440 nm 处1 cm光径比色，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

1.2.5 分光光度法测定SOD活性及MDA含量

SOD 活性测定：称取200 mg 组织，以重量∶体积=1∶9比例加入1.8 mL 生理盐水，冰上切碎组织并制备匀浆，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明检测SOD活性。

MDA含量测定：称取100 mg组织，预冷生理盐水制备10%的心肌组织匀浆，离心取上清，按照试剂盒说明检测MDA含量。

1.3 数据统计与分析

数据采用SPSS26.0 统计软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甘草提取液对小鼠心肌梗死面积的影响（见图1、图2）

如图1、图2 可知，对照组小鼠的心肌梗死最严重，与空白对照组相比差异显著（P＜0.05）。与对照组相比，各剂量组小鼠心肌梗死面积均缩小，且以高剂量甘草提取液降低小鼠心肌梗死的效果最好（P＜0.05）。

2.2 甘草提取液对小鼠CK及LDH活性的影响（见表1）

由表1可知，与空白对照组相比，对照组小鼠血清CK和LDH活性均显著增加（P＜0.05）。与对照组相比，甘草提取液高、中、低剂量组小鼠血清CK 活性均显著降低（P＜0.05），高、中剂量组中LDH活性显著降低（P＜0.05）。

2.3 甘草提取液对小鼠SOD 活性及MDA 含量的影响（见表2）

由表2可知，与空白对照组相比，对照组小鼠心肌组织中SOD 活性显著降低（P＜0.05），MDA 含量显著升高（P＜0.05）。与对照组相比，甘草提取液高、中、低剂量组小鼠心肌组织中SOD 活性显著升高（P＜0.05），MDA 含量显 著降低（P＜0.05）。

图1 甘草提取液对小鼠心肌梗死面积的影响Fig.1 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the area of myocardial infarction in mice

图2 甘草提取液对小鼠心肌梗死面积的影响Fig.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the area of myocardial infarction in mice

表1 甘草提取液对小鼠CK及LDH活性的影响Tab.1 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on the activity of CK and LDH in mice

表2 甘草提取液对小鼠SOD活性及MDA含量的影响Tab.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis Fisch.extract on SOD activity and MDA content in mice

3 讨论

心肌细胞与其他组织和肌肉不同，糖原储备非常有限，导致心肌代谢几乎完全是有氧代谢。因此，心肌耗氧量（MVO2）和心肌氧输送间的平衡对促进心室功能和避免心肌缺血是必要的[8]。氧化应激反应常出现于各种心肌疾病过程，可通过自由基的水平判断心肌受损的程度。发生心肌缺血时，活性氧簇（ROS）升高，激活了氧化应激，进而引起心肌损伤[9]。

心脏中自由基清除酶，如SOD、CAT 和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是细胞抵御氧化应激的第一道防线，可消除超氧化物和羟基自由基。内源性抗氧化防御系统和ROS 产生之间的平衡决定了缺血性损伤的严重程度。削弱抗氧化防御机制，异丙肾上腺素（ISP）更易导致心肌受到脂质过氧化影响。脂质过氧化是一种心肌膜的氧化变性，心肌膜内的多不饱和脂肪酸可能是ROS和过氧自由基的主要靶点，可引发脂质过氧化的连锁反应[10-11]。

本研究中，MDA含量增加可证明ISP给药会诱导脂质过氧化。MDA 含量的增加是由于抗氧化防御受损。因此，自由基并未被有效中和，并导致心肌膜损伤。在本试验中，甘草提取液的预处理降低了MDA含量，原因是心肌抗氧化剂的活性增加或者ROS 的抑制。心肌细胞损伤的标志物包括CK-MB 同工酶和LDH，其中CK-MB 同工酶活性因其心脏组织的特异性、敏感性和催化活性成为诊断标志物之一。心肌损伤时，心肌膜脂过氧化导致细胞和亚细胞成分的分解和多孔通透性增加，心肌细胞释放出来心肌损伤标志酶。此外，心肌损伤标志酶CK-MB和LDH的消耗也证明了ISP诱导的心肌缺血发生。

中草药和药用植物具有潜在的益处，是抗氧化剂的重要来源，人们对草药、药用植物和膳食产生浓厚的兴趣。植物可产生大量化学物质，被认为是药用生物活性化合物和开发药物的先导化合物的储存库。有研究表明，药用植物提取物和植物化学物质可作为植物治疗剂，并预防缺血性心脏病，可筛选具有抗氧化活性的中草药，进一步验证其提取物保护心脏的潜力[12]。

甘草作为膳食和药物被食用已有4 000 多年的历史，在食品、糖果、口香糖、牙膏、饮料和烟草中用作甜味剂和调味剂。甘草具有多种治疗特性，如降血糖、降胆固醇、抗溃疡、抗炎、肾脏保护和抗动脉粥样硬化等，是传统医学中处方最多的草药之一[13-14]。目前，甘草中的主要活性成分包括甘草酸、甘草甜素和异黄酮和异甘草素等[15-16]。本研究表明，甘草提取物的抗氧化和清除自由基的活性可对抗氧化应激。此外，甘草在动物研究中已被证明是无毒的，在人体治疗剂量下更安全。本研究中，丙二醛（MDA）含量增加可以证明，ISP给药能够诱导脂质过氧化。MDA的增加是因抗氧化防御受损，故自由基未被有效中和，并导致心肌膜损伤。

4 结论

甘草提取液可通过降低心肌缺血小鼠CK 和LDH 的活性，减少MDA的含量，提高SOD活性，减轻氧化应激损伤以及心肌缺血造成的损伤。