加米霉素注射液的溶血性与肌肉刺激性试验研究

江国亮，付良凯，辜质纯，李成应，周淑贞

（佛山市南海东方澳龙制药有限公司，广东 佛山 528234）

加米霉素（gamithromycin）是一种半合成、动物专用15 元环大环内酯类抗生素，经发酵和有机合成制备而成。加米霉素的作用机理是选择性地与细菌核糖体50S 亚基结合，通过阻断多肽链延长抑制细菌蛋白质合成。2008 年，加米霉素被欧洲药品局（EMA）批准应用于防治溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和睡眠嗜组织菌引起的牛呼吸道疾病。2016年，经欧盟批准应用于治疗猪由胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌引起的猪呼吸道疾病，并于2017年批准应用于治疗羊由节瘤偶蹄形菌和坏死梭形杆菌引起的传染性腐蹄病。法国梅里亚公司的加米霉素注射液于2017 年在我国农业农村部完成进口兽药注册，正式进入国内市场合法销售[1]。同时，国内多个厂家也完成了该产品的研制，获得新兽药注册批准并上市[2]。

加米霉素注射液注射给药后吸收迅速，生物利用度高，可在肺组织中迅速聚集，组织中药物浓度远大于血药浓度，在靶动物肺组织中维持时间长、药效持久，具有广阔的应用前景[3-5]。大环内酯类药物肌肉注射给药容易引起给药部位的短暂肿胀，并引发轻微疼痛[6]。因此，为评估加米霉素注射液的安全性，本研究对加米霉素注射液进行溶血性试验和注射给药部位刺激性试验，以期为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品与试剂

加米霉素注射液（规格：100 mL∶15 g，批号：20210401B，含量：100.4%），由佛山市南海东方澳龙制药有限公司提供；0.9%氯化钠注射液（规格：100 mL∶0.9 g，批号：5220050330，广东利泰制药股份有限公司）；甲醛溶液（规格：2.5 L/桶，批号：C13066534，上海麦克林生化科技有限公司）；10%福尔马林溶液。

1.2 试验动物

试验动物选择19 只新西兰白兔（普通级），体重2.0～2.5 kg，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号为SCXK（粤）2019-0035。

1.3 试验方法

1.3.1 溶血性试验

选择1 只试验兔心脏采血约50 mL，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10 min，除去纤维蛋白原，制成脱纤血液。加入约10 倍量的0.9%氯化钠注射液摇匀，1 500 r/min 离心15 min，除去上清液，重复洗涤，得到沉淀的红细胞。将所得红细胞以0.9%氯化钠溶液配制2%的混悬液。取7支试管并编号，分别加入相应量的0.9%氯化钠注射液、蒸馏水、2%红细胞混悬液和加米霉素注射液。各试管添加物质及体积见表1。

各试管摇匀，37 ℃恒温孵育，分别于15、30 min 以及1、2 和3 h 观察溶血情况并记录结果。若试管中的溶液为澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；若红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有红棕色或棕红色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生；若有红细胞凝聚的现象，需进一步将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠注射液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，不被冲散者为真凝聚。

表1 溶血性试验各试管添加物质及体积Tab.1 Substances and volume of each test tube in hemolytic test

表2 肌肉刺激反应分级Tab.2 Response grade of muscle irritation test

表3 肌肉刺激反应分值和等级Tab.3 Response score and level of muscle irritation test

18 只试验兔随机分为3 组，分别为低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6只兔子。低、中、高剂量组的给药剂量分别为0.25、0.50 和1.00 mL。试验兔保定后，去毛、消毒，分别于左侧股四头肌注射不同剂量的加米霉素注射液，右侧股四头肌注射等体积0.9%氯化钠注射液为阴性对照组。给药后2、4、24和48 h观察局部反应情况，包括充血、血肿等。

分别于给药后2、14 d耳缘静脉注入空气处死动物（每个时间点各3只），解剖取出兔股四头肌，观察注射给药局部的刺激反应，换算相应的反应级。10%福尔马林浸泡固定，制作病理切片，显微镜下观察股四头肌的炎性细胞浸润、增生、坏死情况。评价该药的刺激反应，计算肌肉刺激性总反应级，计算平均值并判定刺激等级。

2 结果与分析

2.1 加米霉素注射液溶血性试验结果（见图1）

由图1 可知，含不同浓度加米霉素注射液的1～5 号试管中红细胞于3 h内全部下沉，上清液体澄明，未见溶血现象，与6号试管现象一致。7号试管管底无红细胞，试管中的溶液为澄明红色，即发生溶血现象。

2.2 加米霉素注射液肌肉刺激性试验结果（见图2～图4、表4）

图1 加米霉素注射液溶血性试验结果Fig.1 Result of gamithromycin injection hemolysis test

由图2可知，试验新西兰兔肌注加米霉素注射液后2、4、24和48 h肉眼观察注射部位情况。结果显示，各剂量组试验兔各时间点注射部位均未发现充血、红肿等变化，试验兔活动正常。

图2 加米霉素注射液肌肉刺激性试验结果（表观）Fig.2 Result of gamithromycin injection muscle irritation test（apparent）

由图3 可知，对给药后2、14 d 的各试验组新西兰兔注射部位进行解剖观察，发现阴性对照组和低剂量组注射部位股四头肌均无明显异常。

中剂量组给药后2 d时，注射部位出现轻度充血现象；14 d时可观察到有组织增生的修复现象。

高剂量组给药后2 d时，注射部位出现重度充血现象，伴有肌肉变性；14 d 时可观察到中心病灶出现局部变性、坏死情况。

由图4 可知，对给药后2、14 d 的各试验兔注射部位进行肌肉组织病理学检查，发现阴性对照组和低剂量组注射部位肌细胞排列紧密，着色均匀，界限清晰，胞核位于边缘，肌细胞聚集成束，肌束由疏松结缔组织构成的肌束膜包裹，组织未见明显异常。

中剂量组给药后2 d 时，肌肉组织出现少量肌细胞坏死，细胞碎裂，胞核溶解，伴少量上皮样细胞增生，少量炎性细胞浸润。14 d 时可见有局部肌细胞坏死，胞核溶解，伴炎性细胞浸润，可见较多新生毛细血管。

高剂量组给药后2 d 出现组织大片坏死，并可见轻度钙化，坏死灶内较多炎性细胞浸润，可见较多上皮样细胞增生，呈轻度充血。14 d 时可见存在大量肌细胞坏死、胞核溶解，少量肌细胞坏死后钙化，并被多核巨细胞包裹，形成肉芽肿；大量坏死肌纤维溶解，被大量新生肉芽组织取代，肉芽组织内可见大量新生结缔组织以及较多的新生毛细血管。

图3 加米霉素注射液肌肉刺激性试验结果（剖检）Fig.3 Result of gamithromycin injection muscle irritation test（necropsy）

图4 加米霉素注射液肌肉刺激性试验结果（病理切片）Fig.4 Result of gamithromycin injection muscle irritation tes（tpathological section）

由表4可知，根据表2、表3判定标准，判定阴性对照组和低剂量组无明显肌肉刺激性，中剂量组为轻微肌肉刺激性，高剂量组则为中度肌肉刺激性。

结果表明，肌肉注射低剂量加米霉素注射液不产生刺激性反应，随着注射剂量增加，刺激性反应等级增加，刺激性反应表现的局部损伤可逐渐自行修复。

表4 加米霉素注射液肌肉刺激性反应评分与等级Tab.4 Response score and level of muscle irritation test about gamithromycin injection

3 讨论

注射液为高风险药品，给药后可能引起免疫性或非免疫性溶血。因此，在研制注射液时需要观察该药品是否可能引起溶血和红细胞凝集反应。注射液的肌肉刺激性试验是为了观察肌肉组织在局部注射给药后是否引起红肿、充血、浸出、变性或坏死等局部反应，并评估其刺激性反应的可逆程度，以确保临床用药安全[7]。

加米霉素注射液的急性毒性试验表明，小鼠皮下注射的半数致死量（LD50）为1 094.2 mg/kg BW[8]，大鼠经口染毒的LD50为2 219.14 mg/kg BW[9]，属低毒性药物。本研究的溶血性试验中，加米霉素注射液在3 h 内对兔红细胞不产生溶血和凝聚反应，说明加米霉素注射液可应用于注射，试验结果与张倩[10]、张云茜等[11]研究结果一致。

肌肉刺激性试验的注射剂量一般可采用高于或等于临床剂量，也可考虑试验动物所能承受的容量以及用量对肌肉组织产生张力等影响因素对剂量进行调整，一般一次最大剂量不超过1 mL[12]。目前，有报道的关于注射液肌肉刺激性试验中，更倾向采用最大剂量的1 mL 进行考察[13-15]。该条件对药物的安全性要求更高，更利于指导临床安全用药。

本研究中，肌刺激性试验的低剂量组注射量约为推荐剂量的3倍，中剂量组约为推荐剂量的6倍。结果表明，低剂量加米霉素注射液对家兔给药部位股四头肌无明显肌肉刺激性，中剂量为轻微刺激性，高剂量则显示为中度刺激性，但肌肉组织病变可逆，试验结果与法国梅里亚原研产品在欧洲药监局公布的注册资料信息一致。资料显示，加米霉素注射液对新西兰兔存在轻微刺激性[3]，且在不良反应监测中发现，给药后注射部位可能出现肿胀，通常于注射后2～4 d内消退[16]。

张云茜等[11]进行加米霉素注射液肌肉刺激性试验研究时，给药剂量分别为1倍（6 mg/kg BW）、3倍和5倍推荐剂量，结果显示，加米霉素注射液对新西兰兔肌肉无刺激性。张倩等[10]研究显示，注射剂量为1 mL 的注射部位出现明显出血斑，但病理切片分析并未发现异常。

本试验研究结果与上述试验报道结果相似，其中的差异可能是由试验条件和受试物不同造成。因此，可推测加米霉素注射液肌肉注射给药具有一定刺激性可能是其固有特性。

4 结论

加米霉素注射液溶血性符合注射液要求，低剂量肌肉注射具有较好安全性，高剂量肌肉注射则具有一定刺激性。本品在临床应用中应用于治疗敏感菌引起的猪、牛呼吸道疾病以及羊的腐蹄病，可通过肌肉注射给药，临床应用时建议避免于同一部位大剂量注射给药，应根据不同给药对象的实际情况多点给药，降低对肌肉组织的刺激。