基于LC-MS技术的中药三七质量评价研究

黄钰青，梅 杰，江正瑾，黄 洋*

(1.广州医科大学 药学院，广东 广州 511436；2.暨南大学 药学院，广东 广州 511486)

三七 [Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen]是五加科植物三七的干燥根和根茎[1]，是我国重要的民族药，其中主要含有三七皂苷[2-3]、黄酮类[4]、挥发油[5]等多种化学成分；具有活血止血[6]、抗肿瘤[7]、降血糖[8]、抗衰老[9]等多种药理作用。但市面上的三七质量参差不齐，且不同质量三七药材之间的价格相差甚远，故建立三七质量评价方法很有必要。《中华人民共和国药典》[1]中收载的三七药用部位是主根、支根和根茎，说明不同药用部位均可入药，但是不同部位的成分是否存在差异，截至目前研究尚少。现有标准中所涉及的方法如液相色谱、薄层色谱法均无法实现三七不同部位的准确区分[1]。本研究基于LC-MS技术结合化学模式识别方法，以期建立三七质量评价模型，试图区分三七不同药用部位，完善其质量标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260超高效液相色谱仪、Agilent OpenLab ChemStation色谱工作站(C.01.05版本)、Agilent 6130单四极杆质谱检测器(美国Agilent Technology公司)；SPSS 21.0软件(美国IBM公司)；SIMCA-P 14.1 软件(瑞典Umetrics公司)；Origin 2018软件(美国Microcal公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；药典筛(浙江上虞市张兴纱筛厂)；KQ2200DE型数控超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司；DHG系列恒温干燥箱(广州市泉宏科学仪器有限公司)；溶剂过滤器、0.22 μm微孔过滤膜(有机系)、0.45 μm微孔过滤膜(水系)均来自天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 试剂与药材

三七皂苷R1(批号CHB190124，纯度≥98%)，人参皂苷Rb2(批号CHB190102，纯度≥98%)，人参皂苷Rb3(批号CHB190103，纯度≥98%)，人参皂苷Rd(批号CHB190127，纯度≥98%)，人参皂苷Re(批号CHB190107，纯度≥98%)，20-人参皂苷Rf(批号CHB190108，纯度≥98%)，20(S)-人参皂苷-Rg2(批号CHB190117，纯度≥98%)，以上标准品均购于成都克洛玛生物科技有限公司，人参皂苷Rb1(批号P19S10U98130，纯度≥98%)，人参皂苷Rc(批号Z10S11B123849，纯度≥98%)，人参皂苷Rg1(批号G30N10Y104330，纯度≥98%)，均购于上海源叶生物科技有限公司。

甲酸(FA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购自德国默克生物科技有限公司，均为色谱纯。样品进样前均用0.22 μm有机滤膜(Bonna-Agela Technologies，天津)过滤。34批样品产地均为云南文山，均购于云南文山市文山三七国际交易市场，其中S1-S7及S25-S29为一批次，S8-S15及S30-S34为二批次，S16-S24为三批次，包括4批绒根、5批剪口、5批根条和20批主根。所有样品均经深圳市药品检验研究院中药室鉴定为该类药材。

2 方法

2.1 高效液相色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：ACN(含0.02%FA)(A)-H2O(含0.02%FA)(B)，梯度洗脱：0～20 min，20%A；20～29 min，20～29%A；29～60 min，29～40%A。流速：1 mL/min；进样量：5 μL；柱温：25 ℃。

三七皂苷存在形式：化合物加钠形式([M+Na]+)；幕帘气：氮气；雾化气：幕帘气；雾化气压力：35 psi；毛细管电压：4.0 kV；操作模式：选择离子模式(SIM)；检测模式：ESI正离子模式；干燥气流速：12 L/min；干燥气温度：350 ℃。三七提取物中分析物的LC-MS裂解信息见表1。

表1 三七提取物中分析物的LC-MS裂解信息

2.2 对照品溶液的制备

分别取三七标准品各适量，精密称定，用甲醇溶解，配成标准品母液，作为对照品溶液，储存于-20 ℃冰箱，备用。经纯甲醇稀释，得到如下浓度的三七混标对照品溶液：0.04 mg/mL的20(S)-人参皂苷-Rg2和人参皂苷Rg1；0.08 mg/mL的人参皂苷Re 及20-人参皂-Rf；0.09 mg/mL的三七皂苷R1；0.12 mg/mL的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc及人参皂苷Rd。用 0.22 μm 微孔滤膜滤过后，取续滤液即得。

2.3 供试品溶液的制备

取过4号筛的三七样品粉末0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液25 mL称定重量，超声处理2次，每次30 min，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 取三七样本S3，按“2.3”条件处理供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样分析，与空白溶剂同法制备所得图谱进行对照，结果见图1。峰1-峰10经单标进样对比及质谱分子量确认，指认其分别为：三七皂苷 R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20-人参皂苷-Rf、20(S)-人参皂苷-Rg2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd。其中Rg1和R1的分离度大于1.5，Rg1的理论塔板数大于6 000，表明该方法符合《中华人民共和国药典》[1]中指纹图谱的基本要求。

图1 空白溶剂及混标溶液的HPLC色谱

2.4.2 重复性 取三七样本S3，平行制备5份供试品溶液(S3-1-S3-5)，在“2.1”色谱条件下进样分析，记录保留时间和峰面积。结果表明，各峰的保留时间相对标准偏差(RSD)为0.08%～1.00%，峰面积的RSD为3.37%～7.80%，表明方法重现性良好，符合指纹图谱相关要求。

2.4.3 精密度 取“2.4.2”中S3-1供试品溶液，在“2.1”色谱条件下连续进样5次，记录保留时间和峰面积。结果表明，各峰保留时间的RSD为0.10%～0.52%，峰面积的RSD为4.01%～7.26%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱相关要求。

3 结果与分析

3.1 指纹图谱的构建

将34批样品的指纹图谱数据导入Origin 2018软件绘制出样品峰的叠加图谱，如图2 所示。发现有6个相似度较高的共有峰，分别标为峰1-峰6。经指认，峰1-峰6所指示的化学成分分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、20(S)-人参皂苷-Rg2、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd。由于这6个共有峰均存在不同部位的三七样品中，难以加以区分，故将引入化学模式识别技术进行研究。

3.2 三七不同部位的化学模式识别研究

3.2.1 数据分析 通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)软件对LC-MS指纹图谱数据进行处理，得到其相似度结果见表2，由于不同药用部位的色谱峰峰面积数据之间的个体差异较大，严重影响统计分析，故采用SPSS 21.0软件中Z-score法，将34批三七不同部位样品峰面积信息，进行标准数据化处理。Z-score标准化方法是目前最常用的多变量综合分析方法之一，计算公式为标准化数据 =(原始数据-均值)/ 标准差。采用 SIMCA-14.1软件来进行聚类分析(HCA)，主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)分析，用于分类模型的建立；当应用PLS-DA法用于分析研究时，通常需要将样品划分为训练集、测试集，前者用于模型的建立，后者用于模型的验证。

3.2.2 HCA 数据标准化处理后，将其导入Simca-P 14.1 软件，进行聚类分析。聚类分析结果如图3-A所示，34批样品的化学信息按照相似性划分为剪口(绿色)、绒根(蓝色)和主根(红色)三个大类，结果发现，化学信息与其他部位差别较大的剪口可实现准确区分，但化学信息相似性较高的其他类别则会出现分类错误，如错误地将S3(主根)样品划分在绒根组别中，且分类类别不能识别根条组别，与按不同分类部位分出来的四组类别有所出入。结果表明，无监督的HCA方法并不能准确地将相似度较高的化学信息的区别并进行区分。

图2 34批三七药材的指纹图谱叠加分析

表2 三七样品来源信息及指纹图谱相似度评价

3.2.3 PCA PCA分析是应用最为广泛的无监督模式识别方法，为直观预览样品的整体分布情况，本研究对34批样品进行PCA分析，如图3-B，得到R2值与Q2值，R2是指变量解释模型分类的能力，数值越大，代表该模型的拟合能力越强；Q2是指变量预测分类模型的能力，其值越大，代表模型的预测能力越好。一般以R2、Q2>0.5为指标，认为模型拟合和预测能力良好，其值越接近1，代表模型越好。结果表明，前3个主成分的累计贡献率为93.9%，其中第一、第二和第三主成分的贡献率分别为46.0%、29.7%和18.3%，可以表征所提取的大部分化学成分信息。且模型的Q2=0.723，代表该模型具备72.3%的预测准确率，即该模型预测能力较强。由图3-B可见，样品初步按不同部位分为四类且因散点图分布较近，质量很接近。绿色、蓝色、黄色和红色的聚类中心分别为三七剪口、根条、绒根和主根。其中剪口和绒根可以分别被区分开来，但是主根与根条两个部位之间则无法区分。且由图中红色点所代表的主根S3所在位置所示，它在分类时被分入蓝色的根条类别，显示无监督的PCA法在分类时会造成误判，需要通过有监督的PLS-DA法进行进一步分析。

3.2.4 PLS-DA 本研究随机将其中的20批样品(S1-S15、S25-S29)划分为训练集，另外10批样品作为验证集。首先对训练集进行分析，建立PLS-DA模型，结果如图4-A所示。前三个主成分的累计贡献率为94.2%(R2X=0.942)，第一、第二和第三主成分的贡献率分别为48.7%、29.4%、16.1%，表明可以表征所提取的大部分化学成分信息。样品较好地形成了四个聚类中心，四类成分基本上实现了区分。训练集PLS-DA模型中，模型拟合能力参数为94.2%(R2X)，模型区分参数为72.7%(R2Y)，模型预测度为54.7%(Q2)，表明模型具有良好的稳定性和预测准确性。为验证模型是否过度拟合，对其进行了200次置换检验，结果如图4-B所示，其中R2=0.056 8<0.4，Q2=-0.465<0.05，表明模型没有过度拟合[10]。外部检验。此外，我们还使用14批验证集样品(S16-S24、S30-34)对所建模型进行外部检验。结果如图4-C所示。模型的R2X=0.974、R2Y=0.767和Q2=0.478，验证结果与训练集较吻合，模型判别正确率为100%，进一步证实了模型的准确可靠。

图3 34批三七样品的聚类分析图(A)及主成分分析图(B)

图4 训练集的PLS-DA得分图(A)、内部检验结果(B)及外部检验结果(C)

特征提取。为进一步筛选出对样品分类贡献较大的成分，即质量标记物，选用PLS-DA中最常用的Variable Importance for the Project(VIP)值来评价变量的贡献大小。其中VIP值越大，代表该变量对分类的贡献度越大。一般以VIP值>1.0作为指标，对变量进行筛选，并对其进行组间t检验，得到具有显著差异(P<0.01)的特征峰，即为特征性成分，如图5-A所示。VIP值>1.0的峰分别为峰 5、峰 6、峰 7和峰 4，经与标准品对照，指认其所代表的化合物分别为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和20(S)-人参皂苷-Rg2。

模型再建立及验证。为了验证所筛选的特征性成分是否合理，采用特征峰对训练集样品再次建模，结果如图5-B所示。四类样品得到有效地区分，模型累计贡献率(R2X)为97.5%，可以表征绝大部分的化学信息。且模型区分参数为73.8%(R2Y)，模型预测准确度为56.8%(Q2)。且经特征提取后再建立的PLS-DA模型的S3样本，更接近红色的主根区域了，说明该模型具有更优的拟合能力和分类判别能力。通过对模型进行内部检验(图5-C)，以及外部验证(图5-D)，说明模型具有良好的拟合能力和预测准确度。

其中内部检验的200次置换检验结果如图5-C所示，R2=-0.003 91<0.4，Q2=-0.338<0.05，表明模型没有过度拟合。外部验证结果如图5-D，且模型的累计贡献率(R2X)为100.0%，可以表征所有化学信息，模型区分参数为73.6%(R2Y)，模型预测准确度为52.2%(Q2)，四类样品能够实现有效区分，且模型判别准确率为100%，表明该模型拟合能力较强。

4 讨论

4.1 色谱条件优化

本实验分别考察了不同柱温(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)、不同的流动相体系(0.1%FA/ACN、H2O/ACN和H2O/MeOH)和不同浓度的FA添加剂(0.1%、0.05%和0.02%的FA-H2O/ACN)对峰形、基线、峰响应、分离度等的影响，最终选择25 ℃柱温，使用H2O/ACN流动相，并添加0.02%FA添加剂作为色谱条件。

4.2 与2020版《中华人民共和国药典》的三七指纹图谱比较

对比2020版《中华人民共和国药典》中现有的指标性成分：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷R1，本实验所筛选出的特征性成分与药典规定的指标有重合(人参皂苷Rb1)，但也在药典的基础上更多了三个指标性成分：人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rg2，说明化学模式识别技术的引入可以实现三七不同部位的质量区分，这也说明这些不同药用部位的质量是存在一定的区别，但其药效上的差异还有待进一步研究。

4.3 PLS-DA法和PCA法的R2X、R2Y 和Q2的参数对比

将几种模型进行比较，发现结果如表4所示，PLS-DA模型能够实现四类不同药用部位的准确区分；和特征提取后的PLS-DA相比，R2X、R2Y和Q2均明显提高，表明模型区分能力也有所提升，预测能力符合规定，说明该4个特征成分能够为三七不同药用部位的区分提供更加有效的数据支持。

5 结论

本研究表明通过将化学模式识别方法与LC-MS指纹图谱相结合，建立了区分三七不同部位的PLS-DA模型，所得到的四个特征性成分人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和20(S)-人参皂苷-Rg2，该特征性成分能够较好地实现中药三七四种不同药用部位的区分。这可对三七质量控制标准提供可靠数据与有效补充。