木香烃内酯对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

宋冬林，王玉良

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是最常见的糖尿病慢性并发症之一，是导致终末期肾衰竭的主要原因，其中氧化应激与慢性炎性反应被认为是DKD发病的关键所在，目前DKD的治疗方法主要以低蛋白饮食、控制血糖血压、调节血脂水平等为主。传统中医药具有多层次、多环节、多途径、多靶点的作用特点，木香为常用中药材，其所含木香烃内酯(costunolide,CS)具有抗氧化应激和抗炎作用，可抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)及活化κ基因结合核因子(nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)，产生抗炎作用。同时还具有通过核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/antioxidant responseelement，Nrf2/ARE)依赖途径，产生抗氧化应激作用。本研究旨在探讨CS对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠70只，雄性、8周龄，体重(260±20)g，清洁级,由军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号: SCXK(军)2012-0004。实验前适应性喂养1周，饲养条件：室温恒定于22～25 ℃，相对湿度55%～60%，光照时间12 h/d，食物和纯净水可自由摄取。

1.2 药物及试剂 链脲佐菌素(streptozocin，STZ，Sigma公司)；甘精胰岛素(赛诺菲安万特制药有限公司)；木香烃内酯(中国药品生物制品研究所110765-200710)；血糖仪及试纸(美国强生稳豪倍优型血糖仪)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、核蛋白提取试剂盒(南京建成工程研究所)；Histone H、GAPDH、 NF-кB p65、κB抑制剂激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)兔多克隆抗体(美国CST公司)；Nrf2、血红素氧合酶1(hemeoxygenase1，HO-1)兔单克隆抗体(英国Abcam公司)；二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA试剂盒(天津润泰科技发展有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 随机分出12只设为正常组，予以普通饲料饲养；其余58只大鼠给予高脂高糖饲料(在普通饲料中加入10%猪油和20%蔗糖，混匀干燥后消毒灭菌)8周后，鼠尾静脉注射STZ(30 mg/kg，溶于0.1 mol/L无菌枸橼酸缓冲液，pH 4.4)，注射后72 h检测尾静脉血糖，以连续3 d 血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠成模标准。共剔除7只，造模过程死亡2只，剩余49只随机分为糖尿病组(13只)，胰岛素组(12只)，木香烃内酯低、高剂量组(各12只)。其中CS低、高剂量组每天给予CS灌胃10 mg/kg、20 mg/kg，正常组与糖尿病组均给予等量生理盐水灌胃，胰岛素组每天给予甘精胰岛素皮下注射，2 U/(kg/d)。各组均给药8周。

1.3.2 标本获取与分析 于给药后每周测定各组大鼠体重、血糖。给药8周后，全部大鼠予10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血分离血清测定肌酐、尿素氮浓度，部分血清-80 ℃冻存作相关指标测定，大鼠颈椎脱臼法处死后快速剥离双肾，切取部分肾脏组织4%中性甲醛固定做HE染色病理切片，剩余组织-80 ℃冻存作相关指标测定。

1.3.3 肾组织病理学观察 固定的肾组织，石蜡包埋，常规切片，进行HE染色，切片在光镜下经数字CCD获取图像(×100)。

1.3.4 血清抗氧化指标和肾脏组织炎性因子检测 按照试剂盒说明书步骤检测大鼠血清SOD、GSH及MDA含量，制取肾脏组织匀浆后采用ELISA法检测IL-6、TNF-α表达水平，具体方法依照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.5 测定肾脏组织中Nrf2、HO-1及NF-кB p65、IKKβ表达 取低温冰箱保存的200 mg肾脏组织，用预冷的生理盐水冲洗后，在冰上研磨，利用核蛋白提取试剂盒提取总蛋白和核蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，各组样本分别取总蛋白100 μg变性后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白质分离，后将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜，将膜室温封闭 5 h。与特异性的一抗4 ℃孵育过夜，与二抗室温孵育2 h后，化学发光法显影于X胶片扫描后，核内蛋白以Histone H 作为标准内参，胞浆蛋白以GAPDH作为标准内参。采用 Quantityone图像分析软件对蛋白条带进行分析，蛋白相对表达含量以目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值的比值表示。

2 结 果

2.1 一般情况 正常组大鼠一般情况良好，成模鼠逐渐出现饮水、进食及尿量增加，皮毛凌乱而无光泽，体重增长缓慢，活动减少。药物干预后，CS低、高剂量组与糖尿病组比较，上述表现显著改善。造模过程中死亡2只，CS低剂量组和胰岛素组各死亡1只，CS高剂量组未出现动物死亡。

2.2 CS对糖尿病大鼠血糖及肾功能的影响 药物干预第2周CS高剂量组血糖低于糖尿病组，有统计学差异(=0.035)，第4周CS低剂量组血糖低于糖尿病组，有统计学差异(=0.001)。但CS低、高剂量组血糖水平仍高于胰岛素组(<0.01)。CS治疗组大鼠血清肌酐、尿素氮浓度均低于糖尿病组，肌酐低于胰岛素组(<0.01)，CS高剂量组水平较CS低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠血糖及肾功能变化情况

2.3 CS对糖尿病大鼠肾脏病理改变的影响 HE染色显示:正常组大鼠肾小球结构完整，肾小球囊壁光滑，肾小管上皮排列整齐，系膜细胞分布正常，毛细血管管腔清晰，未见增生及纤维化表现；糖尿病组大鼠肾小球体积增大，肾小球内细胞数目增多，肾小囊变窄，少数肾小球出现轻度硬化，部分肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性，系膜细胞增殖，部分间质小血管玻璃样变性；给药组尤其是CS高剂量组大鼠上述病变明显较糖尿病组减轻，表现为肾小球体积轻度增大，未见肾小球囊粘连，肾小管上皮细胞肿胀较轻，肾小球系膜轻度增宽，基底膜轻度增厚(图1)。

图1 各组糖尿病实验大鼠肾脏组织HE染色结果(×100)

2.4 CS对糖尿病大鼠血清SOD、GSH、MDA及肾脏IL-6、TNF-α的影响 糖尿病组大鼠血清SOD、GSH均显著减少，而CS低、高剂量组SOD、GSH的水平均明显增高。氧化应激产物MDA在糖尿病组中增加，而CS低、高剂量组均显著降低。CS低、高剂量组肾脏组织中IL-6、TNF-α水平均低于糖尿病组，差异有统计学意义。CS高剂量组GSH水平高于CS低剂量组(=0.024)，而IL-6低于CS低剂量组(<0.01)，见表2。

表2 各组糖尿病实验大鼠血清SOD、GSH和MDA的变化情况

2.5 CS对糖尿病大鼠肾脏Nrf2、HO-1、NF-кB p65、IKKβ蛋白表达的影响 糖尿病组肾脏组织中的Nrf2、HO-1蛋白表达较正常组显著降低，而CS低、高剂量治疗均可以显著增加糖尿病大鼠肾脏Nrf2，HO-1蛋白的表达，与糖尿病组比较有统计学差异(<0.05)。糖尿病组肾脏组织中NF-кB p65、IKKβ蛋白表达较正常组显著升高，而CS低、高剂量组均可以显著下调糖尿病大鼠肾脏NF-кB p65、IKKβ蛋白的表达，与糖尿病组相比均具有统计学差异(<0.05)(图2、表3)。

图2 各组糖尿病实验大鼠肾脏组织中NF-кB p65、Nrf2、IKKβ、HO-1蛋白水平

表3 各组糖尿病实验大鼠肾脏中的NF-кB p65、IKKβ、Nrf2、HO-1蛋白变化情况

3 讨 论

糖尿病患者中有20%～40%发生DKD，是糖尿病患者肾衰竭的主要原因。DKD 发病机制复杂，其中氧化应激、炎性反应是DKD 发生发展的重要原因之一。糖代谢紊乱产生过多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可使细胞外基质增加，刺激肾小球系膜细胞增殖，增加血管通透性，引起基底膜增厚、肾小球肥大和硬化。Nrf2是近年新发现的机体抗氧化功能最重要的防御性转导通路的关键转录因子，Nrf2通过调控Ⅱ相酶的表达，诱导机体细胞产生自然保护反应，目前被认为是对抗糖尿病引起的氧化应激及炎性反应的新通路。HO-1是Nrf2/ARE通路转录调节的抗氧化蛋白，其表达与Nrf2具有相关性。单核/巨噬细胞浸润是糖尿病肾病炎性反应的特征性表现之一，NF-κB是介导炎性反应的核转录因子，其过度激活可导致多种炎性反应因子的表达分泌异常。炎性细胞通过分泌TNF-ɑ、IL-1、IL-6 等细胞因子和炎性介质，以及产生ROS等造成肾组织结构的破坏，加速肾小球硬化的进程。

中药木香味辛、苦、性温，入脾、胃、大肠、三焦经，主治脾、胃、大肠、肝胆病。CS是从木香属类植物中提取的一类倍半萜内酯类化合物，具有广泛的药理活性，是中药木香的主要化学成分和质量控制成分之一,具有抗肿瘤、降血糖、抑制机体对乙醇的吸收、抑制微生物活性等作用，以及抗炎和抗氧化双重作用。本研究首次证实，CS对糖尿病大鼠肾脏损伤具有保护作用，可能与降低血糖及减轻氧化应激损伤、抑制慢性炎性反应有关。

本研究发现，CS治疗组大鼠多饮、多尿缓解，体重有所增加，肾脏功能及病理损伤改善明显；CS具有一定的降糖作用且有量效关系，但其降糖作用与胰岛素治疗组相比仍有差距，说明CS缓解糖尿病大鼠症状及改善肾脏结构功能可能还有独立于降糖作用之外的途径。Eliza 等报道了CS的降糖及调脂作用，最初认为是通过抑制NO合成酶的表达而促进胰岛β细胞分泌胰岛素，后续研究证明CS是通过抑制氧化应激而起作用。氧化应激还能加剧胰岛β细胞的凋亡，降低胰岛素的合成与分泌，从而进一步加剧糖代谢紊乱。肾脏对氧化应激比较敏感，因而也是氧化应激的主要靶点。糖代谢紊乱过程中会产生大量氧自由基，这些产物不仅会直接导致肾脏组织和细胞损伤，还可以激活一系列氧化应激相关的损伤信号通路，从而加重氧化损伤。SOD、GSH、维生素E是机体清除氧自由基的屏障，通过抗氧化治疗能够逆转氧化应激对组织的损伤，从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生、发展。

本研究结果显示，糖尿病大鼠的血清中SOD、GSH显著降低，而氧化应激的主要标志物MDA显著增加，CS治疗组可以显著增加SOD、GSH含量，降低MDA的表达，并且CS对糖尿病大鼠血清GSH的影响还具有量效关系。同时CS还可以显著增加氧化应激核心转录因子Nrf2的核内表达，增加Nrf2通路中的核心因子HO-1蛋白的表达。说明CS在改善DKD损伤中可能通过调节Nrf2通路来发挥抗氧化作用。慢性炎性反应是DKD发生与发展的关键因素之一，转录因子NF-кB是控制炎性基因表达的枢纽，NF-кB的过度活化是DKD发生的重要原因。IKK复合体在NF-кB的信号转导途径中起着重要作用, 其中IKKβ是IKK复合体的酶活性亚单位，其激活或者失活将直接影响NF-кB的活化及底物蛋白的磷酸化、降解。

糖尿病相关高血糖、ROS的生成、基化终末产物与其特异性受体的结合等途径均可刺激体内NF-кB的激活,活化的NF-кB进一步介导下游炎性因子、趋化因子的形成和大量释放，这些因子的释放可引发机体慢性炎性反应，造成糖尿病慢性并发症的发生和发展。本研究发现糖尿病大鼠肾脏中NF-кB p65在核内表达增高，同时伴有NF-кB辅助活化因子IKKβ增高；同时还发现，炎性因子IL-6、TNF-α在糖尿病大鼠肾脏组织中也显著升高，而CS可以显著抑制这些炎性因子，所有炎性指标均较糖尿病组明显降低，并且CS对糖尿病大鼠IL-6的降低还具有量效关系。说明CS在缓解DKD损伤中可能通过调节NF-кB通路来发挥抗炎性反应作用。有研究发现CS除抑制NO产生和NF-κB活化外，也能降低MAPKs蛋白激酶的活化和AP-1蛋白的DNA结合活性，从而抑制单核巨噬细胞IL-1β基因的表达。 近期有研究表明，在炎性疾病中CS可下调过度表达的NF-κB，降低组织TNF-α水平起到治疗炎性疾病的作用。由于NF-кB信号通路在许多炎性疾病过程中发挥重要作用，所以成为开发治疗炎性疾病药物的重要靶点。

综上所述，CS可以显著保护糖尿病大鼠早期肾脏损伤，这种保护功能可能是通过调节Nrf2通路来发挥抗氧化作用，以及影响NF-кB通路发挥抗炎的双重作用来实现的。本研究结果为今后CS的临床应用及DKD的防治提供了新的方向，但在CS抗氧化与抗炎作用，以及诊断DKD治疗靶点方面还有待进一步研究。