7-氨噻肟头孢菌素的聚合物分析

胡昌勤 李进 张夏

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

在药物杂质谱(impurity profile)控制中，对β-内酰胺抗生素聚合物的控制是当前国内外关注的热点之一[1]。β-内酰胺抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类，作者已经对青霉素类抗生素聚合物分析的进展进行了综述[2]。头孢菌素作为临床中最重要的一类抗菌药物，是当前国内仿制药一致性评价的热点品种。7位侧链具

有氨噻肟结构的头孢菌素(7-氨噻肟头孢菌素)，在增强对β-内酰胺酶的稳定性、改善抗菌谱等方面具有独特的功能[3]，是第三代头孢菌素的典型代表，且已逐渐发展为一大家族(图1)，根据其3位侧链的特点可分为2组，第1组：主要为口服头孢菌素，其3位的R2基团不易解离；第2组：为注射用头孢菌素，其3位的R2基团易被水解。已知7-氨噻肟结构中的自由氮基通过攻击另一分子的β-内酰胺环可形成聚合物[4-5]；此外，根据对青霉素聚合反应机理的认知[2]，头孢菌素还可以通过羧基攻击另一分子的β-内酰胺环发生聚合反应；而各国药典中给出的头孢噻肟二聚物结构(图2a)提示，氨噻肟结构中的氨基还可以与3位侧链发生聚合反应。由于头孢菌素的3位侧链和6元环结构较青霉素母核更不稳定[6]，聚合物易发生多种降解反应，使得对头孢菌素聚合物结构的分析较青霉素更加困难。伴随着科学技术的进步，近年来人们对β-内酰胺抗生素聚合物的聚合反应机理、结构等的认知不断完善，对7-氨噻肟头孢菌素的聚合物分析也取得了较大的进展[7-12]，但在利用LC-MS进行结构解析中也遇到一些困惑。本文对近年来的工作进行回顾性总结，希望形成相对系统地对该类抗生素聚合物分析及利用LC-MS进行结构解析的策略与方法，进而指导对其他头孢菌素聚合物的分析。

1 7-氨噻肟头孢菌素聚合物

头孢唑肟钠与头孢噻肟钠是氨噻肟头孢菌素的典型代表结构(图1)，前者没有3位侧链，后者的3位侧链易被水解。分别采用凝胶色谱-柱切换-质谱分析技术[2]分析二者强制聚合溶液中的聚合物杂质：在头孢噻肟钠的强制聚合溶液中，主要聚合物为氨基与3位侧链反应(聚合反应I)形成的二聚体(图2a)，没有发现羧基与β-内酰胺环聚合形成的二聚体[10]；在头孢唑肟中仅发现氨基与β-内酰胺环反应(聚合反应Ⅱ)形成的一对二聚体非对映异构体(图2b)，也没能发现羧基与β-内酰胺环的聚合反应产物(图2c)[13-14]。上述结果提示，在7-氨噻肟头孢菌素的聚合反应中，氨基是主要的聚合活性位点，羧基与β-内酰胺环的聚合反应不易发生。进一步分析头孢噻肟钠中的各类聚合物(图3A)，在按聚合反应I形成的聚合物中，主要聚合产物为二聚体(简称二聚体I)，没能发现聚合反应Ⅱ形成的二聚体(简称二聚体Ⅱ)，但发现多个二聚体Ⅱ侧链水解形成的水解产物。由头孢菌素的降解反应机理[15-16]可知，理论上二聚体Ⅱ的侧链水解可形成4种不同的水解产物，将其分别命名为水解物I-Ⅳ(图3B)；图3A的结果提示，第2组头孢菌素由于其3位具有易解离基团，形成的二聚体Ⅱ不稳定，在强制降解反应中易被进一步水解成不同的水解物。

2 7-氨噻肟头孢菌素聚合物的特性

第2组氨噻肟头孢菌素(图1)中的聚合物主要为聚合反应I的产物。以二聚体I为例，它们具有相似的二级质谱图(图4A)，共性裂解途径产生m/z791、m/z636和m/z396的碎片离子，其中b裂解是重要的特征裂解片途径(图4B)。由于二聚体I分子呈线性构型(图5A)，该特性不仅使其易形成高聚合度的多聚体，如在头孢噻肟钠中已发现三聚体、四聚体[10]，且使得多聚体具有与二聚体相似的质谱裂解途径(图5B)，对二聚体I特征裂解途径的认知，对三聚体、四聚体的解析具有重要的意义(图5C)。

分析聚合反应Ⅱ产物的质谱裂解特性。以头孢唑肟二聚体为例(图6A)，其共性裂解途径可产生m/z624、m/z481、m/z449和m/z383的特征离子，并易产生脱羟基、羧基等碎片离子，其中a裂解产生的头孢唑肟[M+H]+峰是重要的特征裂解片途径(图6B)，是判断二聚体Ⅱ水解物的重要依据；脱羧基反应(d裂解)与脱羟基反应同时存在，是判断二聚体3位侧链是否形成内酯结构的重要依据。

3 7-氨噻肟头孢菌素聚合物的衍生物/降解物

3.1 3位侧链水解物

第2组头孢菌素的3位侧链易发生水解反应，如何判断聚合物中侧链的水解位置是推测水解物结构的关键。质谱裂解途径结合RP-HPLC保留值分析是较好的分析策略。

比较头孢曲松二聚体Ⅱ不同侧链水解物的空间构型(图7A)，水解物Ⅲ和水解物Ⅳ的空间构型较对应的水解物Ⅰ和水解物Ⅱ更松散，使其保留值较水解物Ⅰ和水解物Ⅱ大；水解物Ⅱ和水解物Ⅳ分别较水解物Ⅰ和水解物Ⅲ的空间构型更紧凑，故水解物Ⅱ/水解物Ⅳ中至少一个异构体的保留值较水解物Ⅰ/水解物Ⅲ更小。即利用RP-HPLC的保留值可帮助判断聚合物水解物的水解位点。头孢噻肟聚合物的RPHPLC分析较好地验证了上述规律(图3A)。

以对头孢噻肟二聚体水解物(MW850)的分析为例说明质谱解析二聚体水解物的过程。虽然二聚体Ⅱ侧链水解形成的羟基体或内酯结构(图3)的分子量均可为850 Da，但二级质谱图(图7B)中仅见脱羧基碎片，未见脱羟基碎片，提示其可能为内酯结构；结合头孢噻肟钠的质谱裂解规律[17]，质谱图中m/z456的碎片峰及可由头孢噻肟分子裂解产生的m/z396、m/z353、m/z324和m/z227特征离子，提示m/z456的碎片峰为头孢噻肟的[M+H]+加合离子峰；再结合保留值推测其为头孢噻肟二聚体Ⅱ水解物Ⅳ(图7C)。

3.2 3位丙烯基异构化产物

第1组7-氨噻肟头孢菌素中3位具有丙烯基结构的头孢菌素(图1)如头孢丙烯、头孢克肟，主要通过聚合反应Ⅱ应形成聚合物，R1结构的差异对聚合反应没有明显影响，但聚合过程中β-内酰胺环开环易形成γ-内酯并发生异构化，使得聚合物呈多种异构体。如头孢地尼的3位的丙烯基结构在酸性及中性条件下异构化，理论上可形成8种异构体(具有3个手性位点)[18-19]，提示头孢地尼二聚体(二聚体Ⅱ)也可能在聚合中形成多种具有相同分子量的二聚体γ-内酯。如在分析头孢地尼聚合物时[12]，杂质Unk-7-10四个杂质峰的一级和二级质谱图完全一致，它们的相对分子质量均为790 Da；结合头孢地尼的质谱裂解规律[17]分析其可能的裂解途径：二级质谱图中仅发现m/z744的脱羧基碎片，m/z773的脱羟基碎片不明显，且发现m/z158的特征碎片，提示3位侧链为内酯结构；而特征的m/z396和m/z242离子碎片，提示形成了头孢地尼[M+H]+加合离子峰，进而推测出二聚体γ-内酯的异构化位点(图8)。

比较头孢地尼、头孢克肟二聚体和其γ-内酯在RP-HPLC中的保留值，二者γ-内酯的保留值均大于二聚体，该结果也可用于对聚合物结构的验证。

3.3 7位侧链衍生物

采用凝胶色谱-柱切换-质谱技术分析头孢他啶中的聚合物[8]，发现两个分子量为1159 Da的聚合物杂质(HPSEC-2a 和HPSEC-2c)，比头孢他啶二聚体Ⅰ的分子量多146 Da，命名为头孢他啶二聚体衍生物I；同时，发现2个为692 Da的杂质(HPSEC-4a和HPSEC-4b)，比头孢他啶的分子量多146 Da；此外，还发现两个分子量为1115 Da的聚合物杂质(HPSEC-3c和HPSEC-3f)，比头孢他啶二聚体衍生物I的分子量少44 Da，命名为头孢他啶二聚体衍生物Ⅱ；依据质谱分析结果，推测他们的取代位点均为7位侧链。虽然文献[8]对他们的可能结构进行了推断，但无法合理解释在强制聚合溶液中他们的形成机制。由于HPSEC-2a和HPSEC-2c的二级质谱图基本相同，HPSEC-4a和HPSEC-4b的二级质谱图基本相同，推测他们的产生途径相似，因此，对分子量为692的杂质的结构解析，将有助于推测头孢他啶二聚体衍生物Ⅰ的结构。

由头孢菌素的降解反应机理可知，伴随着β-内酰胺环的开环，可发生系列重排、降解反应[15-16]。依据该降解反应机理，头孢他啶二聚体Ⅰ水解可以形成分子量为692的头孢他啶降解物，该衍生物为顺反异构体(图9A)，这可以较好地解释头孢他啶二聚体衍生物I的来源，即由头孢他啶7位侧链的氨基与该降解物的3位侧链聚合产生(图9B)。而头孢他啶二聚体衍生物Ⅱ则可能是分子量为692的头孢他啶降解物进一步脱羧，形成分子量为648的降解物(图9A)，该降解物与另一分子头孢他啶按聚合反应Ⅱ途径聚合，同时3位侧链水解形成内酯，产生分子量为1115 Da的二聚体衍生物Ⅱ，对其质谱裂解途径的分析(没有发现头孢他啶的分子离子峰，证明其为水解物Ⅲ)支持所推测结构的正确性(图9C)。

3.4 氨基与羧基酰化反应脱水物

在对头孢噻肟、头孢克肟和头孢他啶的聚合物分析中，分别发现分子量为832 Da(HPSEC-4)、分子量为888 Da(HPSEC-3h)和分子量为1541 Da(HPSEC-3g, 3h)的聚合物杂质，他们均被认为由氨基与羧基的酰化反应产生，但HPSEC-4被认为是头孢噻肟二聚体I的分子内脱水产物[10]，HPSEC-3h被认为是头孢克肟分子间脱水形成的二聚体[11]，HPSEC-3g, 3h被认为是头孢他啶分子间脱水形成的三聚体[8]。虽然对青霉素分子聚合反应的理论计算表明，药物分子侧链的氨基与另一分子2位羧基的反应较其他聚合反应途径较难发生[20]，但上述结果提示，在强制聚合过程中7-氨噻肟头孢菌素中的氨基与母核羧基的酰化反应确已发生，但究竟更易发生分子内酰化反应还是分子间酰化反应尚不能给出明确的答案。

头孢噻肟二聚体I整个分子呈线性构型(图5A)，氨基与羧基在分子的两端，不利于发生分子内的酰化反应；对头孢克肟二聚体差向异构体的空间构型分析同样得出其不利于发生分子内的酰化反应的结论(图10A)；故认为理论上7-氨噻肟头孢菌素的氨基与羧基的分子间酰化反应更容易发生。重新推测头孢噻肟中HPSEC-4杂质(MW832)的可能结构，认为其更可能为头孢噻肟分子间脱水形成的二聚体水解物，质谱裂解途径分析支持新推测结构的合理性(图10B)。同理，头孢他啶三聚体的空间构型也不利于氨基与羧基发生分子内的酰化反应。重新推测HPSEC-3g,3h(分子量为1541 Da的头孢他啶三聚体脱水物)的可能结构：由于二者的二级质谱图相似，提示二者为同分异构体，可能为聚合反应Ⅱ的产物；未发现特征的m/z547碎片，提示质谱分析中未产生特征的头孢他啶[M+1]+峰；结合已知的头孢菌素质谱裂解规律，对其质谱图中的碎片峰进行归属，认为其最可能结构是头孢他啶二聚体Ⅱ的羧基与另一分子头孢他啶的氨基发生的分子间酰化产物的水解物(图10C)。

3.5 二聚体脱氢物

采用LC-MS法分析头孢克肟中的杂质unk-6和unk-7，二者的分子量均为904 Da，较头孢克肟二聚体少2 Da，提示发生了脱氢反应；二者的二级质谱图差异明显(图11A)，在RP-HPLC中的保留值相差也较大，提示二者的结构可能不完全不同。文献[11]认为二者的结构相同，且所推测的结构无法从机理上解释在强制聚合溶液(偏碱性水溶液)中他们的产生过程。由头孢地尼的异构化机理[18-19]可知，β-内酰胺开环可导致3位侧链的双键转移，使得氢化噻嗪环中的电子云分布发生变化，进而发生双键的重排，形成脱氢反应(图11B)。分子量为904 Da的头孢克肟脱氢二聚体，可以先按氨基与β-内酰胺环聚合(聚合反应Ⅱ)途径形成二聚体，再脱氢形成头孢克肟脱氢二聚体Ⅰ(图11C)，也可以先按羧基与β-内酰胺环聚合形成二聚体(不含氨基头孢菌素的常见聚合反应途径)，再脱氢形成头孢克肟脱氢二聚体Ⅱ(图11D)。从聚合反应机理的角度，脱氢二聚体Ⅰ较脱氢二聚体Ⅱ更易产生；LogP值的计算提示脱氢二聚体Ⅱ的极性更大，在RP-HPLC中的保留值应较小；强制聚合溶液分析显示，Unk-7的保留值较Unk-6大，其产生量也较Unk-6大，因此推测Unk-7可能为脱氢二聚体I，Unk-6可能为脱氢二聚体Ⅱ。结合头孢菌素的质谱裂解规律，分别对二者质谱图中的碎片峰进行归属：Unk-7中m/z736和m/z768的特征裂解碎片，提示分子中存在完整的β-内酰胺环结构，裂解途径分析支持Unk-7可能为脱氢二聚体I(图11C)； Unk-6的质谱裂解途径分析支持其可能为脱氢二聚体Ⅱ(图11D)。

3.6 氢化噻嗪环降解物

按聚合反应Ⅱ等途径形成的头孢菌素聚合物分子中通常含有β-内酰胺环开环结构，开环分子中的氢化噻嗪环可进一步水解形成巯基，继而再发生重排、水解等降解反应[15-16]。如头孢克肟强制降解溶液中的杂质Unk-5(MW828)、HPSEC-3i(MW797)等。

对头孢克肟杂质Unk-5进行解析。虽然分子量为828 Da的降解物可能由氨基与β-内酰胺环形成的二聚体降解产生，也可能由羧基与β-内酰胺环形成的二聚体降解产生，但其质谱图中m/z811、m/z783、m/z739的特征碎片峰提示分子中存在完整的β-酰胺环，未发现m/z454的头孢克肟[M+H]+峰，仅出现特征的m/z545碎片(β-内酰胺环裂解产生)；进而推测其可能为羧基与β-内酰胺环形成的头孢克肟二聚体的降解产物，对其可能的质谱裂解途径分析见图12A。而对杂质HPSEC-3i(MW797)的解析，提示其是由氨基与β-内酰胺环形成的头孢克肟二聚体降解产生(图12B)。

4 总结

7-氨噻肟头孢菌素的聚合反应主要与7位侧链的氨基有关。对3位不含可解离基团的第1组头孢菌素，聚合反应主要由氨基攻击另一分子的β-内酰胺环发生，聚合物为一对差向异构体；对3位具有可解离基团的第2组头孢菌素，聚合反应既可通过氨基攻击另一分子的3位侧链(聚合反应Ⅰ)发生，也可以通过氨基攻击另一分子的β-内酰胺环(聚合反应Ⅱ)发生。

由头孢菌素的结构特点可知，其聚合物结构具有不稳定性，进而导致了聚合物结构的多样性。如第1组具有丙烯基结构的头孢菌素，其易形成γ-内酯并发生差向异构化，理论上二聚体可以形成8种γ-内酯；第2组头孢菌素，其3位侧链易水解形成羟基体、内酯结构，理论上每一种由聚合反应Ⅱ形成的二聚体水解可形成8种异构体。此外，氨噻肟头孢菌素聚合物中还发现一些偶见的特殊衍生物/降解物，包括：7位氨基衍生物，如头孢他啶、头孢甲肟中发现较二聚体I多146 Da的二聚体衍生物等；氢化噻嗪环水降解物，如分子量为828 Da的头孢克肟二聚体降解物等；3位丙烯基结构脱氢物，如头孢克肟脱氢二聚体等。而7-氨噻肟头孢菌素中的偶见聚合反应途径，如侧链的氨基与另一分子母核羧基的酰化反应，母核的羧基攻击另一分子β-酰胺环的聚合反应，更使得7-氨噻肟头孢菌素的聚合物具有高度的复杂性。

针对头孢菌素聚合物的结构特点，采用LC-MS技术推测聚合物的结构时，首先应根据具体头孢菌素的结构确定其最可能的聚合反应途径；其次根据LC-MS给出的分子量信息及对头孢菌素降解反应的认知，推测出各种可能的结构；第三，基于对头孢菌素及聚合物质谱裂解规律的认知，对聚合物二级质谱中的主要碎片峰进行归属，确认最可能的结构；最后利用RP-HPLC的保留值验证所确认结构的正确性。

虽然头孢菌素聚合物的结构具有多样性，然而在对实际样品的分析时发现通常存在明显的指针性聚合物，如第1组头孢菌素的二聚体，第2组头孢菌素的二聚体I，他们的含量可基本表征产品中总聚合物的水平，使得利用更专属的RP-HPLC方法控制产品中的聚合物含量成为可能。