利奈唑胺葡萄糖注射液的质量分析

裘亚 张含智 丁颖 吕丹丹 赵敬丹 张梦悦 刘浩

(上海市食品药品检验研究院，上海 201203)

利奈唑胺(linezolid)是由美国Pharmacia & Upjohn公司(已被Pfizer公司收购)研制开发的首个恶唑烷酮类抗菌药物(图1)，主要用于治疗革兰阳性菌及多重耐药菌引起的感染；2000年在美国上市[1]，2006年在中国获批上市。目前国内上市的剂型包括利奈唑胺片、利奈唑胺干混悬剂和利奈唑胺葡萄糖注射液。国产利奈唑胺葡萄糖注射液于2015年获批上市。2020年利奈唑胺葡萄糖注射液被列为国家评价性抽验品种。

根据国家药品监督管理局药品数据信息，利奈唑胺葡萄糖注射液共有9家生产企业(8家国内生产企业和1家国外生产企业)，17个批准文号，2种规格，分别为100 mL(0.2 g利奈唑胺)和300 mL(0.6 g利奈唑胺)。本次抽验共完成83批样品的检验，规格包括100 mL(57批)和300 mL(26批)；涉及5家制剂生产企业，7个批准文号；从生产企业、经营企业和医疗机构抽取的样品占比分别为13.3%、66.3%和20.5%。经调研，各制剂生产企业所用利奈唑胺原料药合成工艺均存在差异；药用辅料包括葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠和注射用水，其中不同企业的产品处方中柠檬酸和柠檬酸钠的用量稍有差异。

中国药典2015年版、欧洲药典10.0版、英国药典2020年版、美国药典43版及日本药典17版均未收载利奈唑胺葡萄糖注射液；仅美国药典43版收载利奈唑胺。利奈唑胺葡萄糖注射液的现行法定执行标准均为国家食品药品监督管理局标准。本研究依据现行药品质量标准的检验结果，结合探索性研究情况，对当前利奈唑胺葡萄糖注射液的质量状况进行客观评价与分析，并对现行法定质量标准提出改进建议。

1 仪器与试药

Waters 2695e型高效液相色谱仪；Agilent 1260型高效液相色谱仪；Agilent 1100-6550型高效液相-四极杆-飞行时间质谱联用仪；Agilent1200-AB Sciex 5000型Q-Trap液相质谱联用仪；Agilent 8800型电感耦合等离子体质谱仪。

83批次利奈唑胺葡萄糖注射液均为2020年度国家药品评价性抽验样品，涉及5 个生产企业(A、B、C、D和E企业)；利奈唑胺(USP，批号：R072F0，99.6%)；葡萄糖(EP，批号：1.0，91.0%)；3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺(阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：C1907130，98.0%)；BHA(批号：81202899，98%)、BHT(批号：MCCC0032，99.0%)、TBHQ(批号：S2E7J-OM，98.0%)、抗氧剂1010(批号：MKCK3424，98%)、抗氧剂330(批号：MKBW7797V，99.0%)、抗氧剂1076(批号：MKCK8428，99%)均来自于阿法埃莎化学有限公司；多元素标准溶液(国家有色金属与电子材料分析测试中心，批号195044-2)；钯标准溶液(国家有色金属与电子材料分析测试中心，批号189029)；混合内标溶液(Agilent，批号1-152YJY2)；乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸均为色谱纯，正己烷、无水乙醇、异丙醇、二乙胺和三乙胺均为分析纯，水为超纯水。

2 实验方法

2.1 法定检验方法

83批样品的法定质量标准分别为国家药品监督管理局进口药品注册标准JX20180010、国家局标准YBH01092015、YBH01882016、YBH03822018和YBH00132019。主要检验项目包括鉴别、对映异构体、有关物质、葡萄糖和含量测定等。

2.2 探索性研究方法

2.2.1 有关物质

色谱柱：Zorbax SB C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A：0.1%三氟乙酸溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液；线性梯度洗脱(0～2 min，B为10%；2～20 min，B为10%→20%；20～35 min，B为20%→75%；35～45 min，B为75%；45～50 min，B为75%→10%；5 0 ～5 5 m i n，B 为1 0%)；流速：1.0 m L/m i n；柱温：35℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；样品浓度：1.0 mg/mL。

质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子模式采集，扫描范围(m/z)：50～1200，毛细管电压：3500 V，锥孔电压：1000 V，去溶剂温度：200℃，干燥气流量：14 L/min，碰撞电压分别为10、20和30 eV。

2.2.2 对映异构体检查

色谱柱：KR CHI-DMB(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：正己烷-无水乙醇-三乙胺(600:400:2)；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；样品浓度：0.4 mg/mL。

2.2.3 葡萄糖含量测定

色谱柱：YMC-Pack PolyamineⅡ(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈-水(75:25)；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；示差折光检测器；进样量：100μL；样品浓度：2.5 mg/mL。

2.2.4 潜在基因毒性杂质的检测

色谱柱：Agilent poroshell EC-C18(2.7 μm，4.6 mm×50 mm)；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：乙腈，线性梯度洗脱(0～5min，B为10%→30%；5～5.1 min，B为30%→90%；5.1～8 min，B为90%；8～8.1 min，B为90%→10%；8.1～12 min， B为10%)；流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL。

质谱参数：采用电喷雾离子源，正离子模式采集；离子源温度：500℃；电喷雾电压：5500 V；CUR：20 L/min；CAD：Medium L/min；GS1：35 L/min；GS2：35 L/min；定量离子对：197.2-131.1；定性离子对：197.2-111.1。

对照品溶液的配制：称取适量的3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺对照品用10%乙腈溶液溶解稀释并制成2500 ng/mL的溶液，作为线性储备溶液，精密量取适量，用10%乙腈溶液稀释分别制成1、5、25、50、100和250 ng/mL的溶液，作为S1～S6线性对照品溶液。

供试品溶液的配制：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液1 mL，加10%乙腈溶液1.0 mL，混匀。

2.2.5 包材相容性研究

抗氧剂：色谱柱：YMC ODS-AM(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相A：水；流动相B：乙腈；线性梯度洗脱(0～7 min，B为35%；7～14 min，B为35%→98%；14～42 min，B为98%；42～43 min，B为98%→35%；45～50 min，B为35%)；流速：1.9 mL/min；柱温：35℃；检测波长：276 nm；对照品溶液进样量：10 μL；供试品溶液进样量：100 μL。

金属元素：氦碰撞单四级杆模式；功率1550 W；采样深度10.0 mm；载气流量0.50 L/min；雾化器泵速0.10 r/s；S/C温度2℃；重复读数次数3次；分析模式全定量。

3 实验结果与讨论

3.1 法定检验结果

按法定质量标准检验，83批利奈唑胺葡萄糖注射液的合格率为100%；但因各法定标准主要检验项目的方法及控制限度均存在差异，故难以根据法定标准检验结果对不同企业的产品质量进行比较。

3.2 探索性研究结果

3.2.1 有关物质

本次国抽样品涉及的法定标准中JX20180010、YBH01092015、YBH01882016和YBH03822018标准采用了以0.1%三氟乙酸溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相体系的梯度洗脱HPLC 系统，YBH00132019标准采用了以0.1%三乙胺溶液-甲醇为流动相体系的梯度洗脱HPLC系统；且各标准中所控制的特定杂质的名称、数量和限度均各不相同(各标准共计含15个特定杂质)。美国药典43版中利奈唑胺有关物质检查采用以磷酸二氢钾溶液-甲醇-乙腈为流动相体系的梯度洗脱HPLC 系统，并对3个特定杂质的限度进行了规定。在本部分探索性研究中，在对上述有关物质系统进行比较分析的基础上，优化建立了能对利奈唑胺葡萄糖注射液中15个已知杂质进行有效分离的HPLC系统[2]，见“2.2.1”，系统适用性图谱和各杂质结构分别如图2和表1所示。采用新建的有关物质方法对83批抽验样品进行分析，各企业样品测定结果如表2所示。

表1 各杂质分子式、化学结构和来源Tab.1 Proposed molecular formulas, structures and sources of impurities 1～15

表2 各企业产品有关物质测定结果Tab.2 The related substance results of the samples from different manufacturers

由测定结果可以看到，不同企业产品中各杂质水平基本相当，杂质总量均在1.0%左右，且除部分样品中有少量工艺杂质(杂质5)检出外，检出的其余6个已知杂质均为降解杂质；提示虽然目前各制剂企业所用利奈唑胺原料药的合成工艺存在着差异，但经纯化工艺后均能有效地将工艺杂质去除。C企业和D企业产品中有1个含量大于0.10%且保留时间相同的未知杂质检出，采用LC-Q-TOF对该杂质结构进行了初步分析[2]。

3.2.2 对映异构体

利奈唑胺分子结构中含1个手性中心，其存在一个对映异构体[3]。5个法定质量标准均采用手性固定相的HPLC法控制样品中的对映异构体杂质，但方法和限度均存在差异。其中，YBH01092015标准采用CHIRALPAK AD-H色谱柱进行测定，YBH03822018标准采用CHIRALPAK AY-H色谱柱进行测定，这两种色谱柱均不宜分析含水供试品；试验结果也证实，多次进样分析后，出现了柱效显著下降的现象。因此，我们选择YBH01882016、YBH00132019和JX20180010标准所采用的Kromasil DMB色谱柱，建立了统一的HPLC测定方法，见“2.2.2”，规定利奈唑胺峰与对映异构体峰的分离度应不小于2.0。

按新建立的方法对83批抽验样品进行分析，A和D企业样品中均未检出对映异构体杂质，B、C和E企业样品中对映异构体杂质的含量均小于0.04%，说明目前各企业制剂所使用的利奈唑胺原料药的生产工艺均能有效控制对映异构体杂质的含量。

3.2.3 葡萄糖含量测定

YBH00132019标准采用旋光度测定法测定样品中的葡萄糖含量，专属性较差；YBH01882016和YBH03822018标准采用容量滴定法(间接碘量法)，对实验环境及实验人员要求较高，且实验操作较为繁琐；YBH01092015和JX20180010标准采用高效液相色谱-示差折光检测法。我们参照YBH01092015和JX20180010标准，建立了统一的HPLC方法，见“2.2.3”。

按拟定的方法对83批抽验样品进行测定，葡萄糖含量均在98.3%～103.5%之间(以标示量计)，平均值为101.0%；各企业产品的葡萄糖含量测定结果比较图见图3，A企业产品的葡萄糖含量相对较低。

3.2.4 潜在基因毒性杂质的检测

函调中反馈的资料显示：3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺为B企业利奈唑胺原料药合成工艺中的中间产物；而C企业和D企业利奈唑胺原料药生产工艺的起始原料均包括了N-苄氧羰基-3-氟-4-吗啉基苯胺，如在后续反应中不能除尽该化合物，则其可能降解生成3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺。3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺为芳香胺类化合物，属潜在基因毒性杂质；B企业和E企业原料药内控标准中均对其进行了控制(限度分别为0.6和16 ppm)；但在注射液中均未对其进行控制。采用LC-MS方法(见“2.2.4”)对各企业代表性样品中的3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺进行了检测；结果如表3所示，各企业产品中均有潜在基因毒性杂质3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺检出。另外，各企业样品在加速稳定性试验(温度40℃，相对湿度75%)条件下放置3个月后，3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的含量均略有增加，提示利奈唑胺在溶液状态中可能降解生成微量的3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺。各制剂生产企业应关注利奈唑胺葡萄糖注射液中的3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的含量变化，必要时在利奈唑胺葡萄糖注射液质量标准中增订3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺检查项，以进一步保证临床用药的安全性。

3.2.5 包材相容性研究

药品与药品包装材料之间的相容性研究已成为目前药品质量研究中的重要组成部分[4]。本次国抽样品有玻璃瓶装和多层共挤输液袋装两种包装形式，见表3。多层共挤输液袋又称软袋，是继玻璃输液瓶、塑料输液瓶之后出现的更为优良的输液产品包装，具有不含黏合剂、增塑剂，热封性好、可高温灭菌、无需排气针、交叉污染风险小和运输方便等优点[5-6]；但为了在存储和使用过程中更加稳定，多层共挤输液袋在加工过程中通常需加入抗氧剂、润滑剂和抑酸剂等助剂，其中常用的抗氧剂主要为酚类抗氧剂，如抗氧剂1010、1076和330等[7]。建立了能同时检测6种常见酚类抗氧剂(BHT、 BHA、TBHQ、330、1010和1076)的HPLC方法(见“2.2.5”)，其检测限分别为0.2、0.2、0.5、1、1和1 μg/mL；对各企业的代表性样品进行检测，均未检出上述抗氧剂。

表3 3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺测定结果Tab.3 The measurement results of 3-fluoro-4-morpholin-4-yl-phenylamine

多层共挤输液袋装加工过程中润滑剂和抑酸剂等助剂的添加，可能会引入少量的有害金属元素，其在与药液长时间接触后可能会迁移至注射液中[8]。另外，玻璃瓶包装的注射液中也可能发生有害金属元素从玻璃瓶迁移至药液的情况[9]。因此，在本部分探索性研究中，我们还采用ICP-MS对各企业代表性样品中的铬、铜、锌、钯、镉、锡、钡和铅等元素残留进行了检测。测定结果显示，按每日摄入最大用量计算，各元素含量均远小于其PDE值。

4 结论

本次评价性抽验采用法定检验结合探索性研究对利奈唑胺葡萄糖注射液的质量和质量标准进行了分析和评价。通过探索性研究，利用建立的能同时对15个已知杂质进行有效分离的高效液相色谱方法，结合LC-Q-TOF技术对样品中含量大于0.10%的未知杂质的初步结构分析，发现各企业样品的杂质谱基本一致；提示虽然目前各制剂企业所用利奈唑胺原料药的合成工艺存在着差异，但经纯化工艺后均能有效地将工艺杂质去除。采用LC-MS对样品中的潜在基因毒性杂质3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺进行了检测，发现各企业产品中均有该杂质检出，且在加速稳定性试验中，3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺的含量略有增加，提示各制剂生产企业应予以关注，必要时应在利奈唑胺葡萄糖注射液质量标准中增订3-氟-4-(4-吗啉基)苯胺检查项。

按照现行法定标准检验，本次抽验样品均符合标准要求。但现行标准均为局颁标准，各标准在检验项目设置、检验方法和限度等方面的规定不尽相同，因此较难通过法定检验结果对不同生产企业之间的产品质量进行比较。提示利奈唑胺葡萄糖注射液的质量标准亟待统一与提高。