光叶子花及紫茉莉科植物叶绿体基因组序列的比较分析*

杨琳懿，赵文植，辛静，董章宏，马路遥，李卫英，王飞，辛培尧

(1.西南林业大学 国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650224)

叶绿体是植物细胞内重要的质体，是进行光合作用的细胞器，其基因组功能与光合作用密切相关[1]。叶绿体拥有一套完整的基因组，其结构大多数为闭合双链环状(伞藻除外)，由四部分组成，2个反向重复区将大、小单拷贝区分隔开。其遗传方式大多属母系遗传[2]，基因组结构组成相对保守，适用于植物系统发育方面的研究，一般IR区是叶绿体基因组最保守的区域，LSC区的进化速率最快[3]，编码区变异程度低于非编码区，不同进化速率的序列适用于不同阶元的系统发育研究[4]。目前越来越多物种的叶绿体基因组被测定研究，其已成为遗传多样性分析、构建和分析系统发育树的有力工具，来进行不同物种间的比较研究[5-6]。

光叶子花(BougainvilleaglabraChoisy)别名三角梅、簕杜鹃等，系紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainvillea)木质藤本状灌木，原产南美洲的巴西，后逐渐引种栽培至我国福建、两广、云南等地，是重要的观赏花卉和优良的园林绿化植物，我国长江流域及以南地区露地种植，以北地区只能温室栽培[7-8]。光叶子花观赏价值极高，另外耐性强，易管理，还可应用于生态环境修复，除此以外，其药用价值也在被进一步挖掘。

紫茉莉科是石竹亚纲(Caryophyllidae)石竹目(Caryophyllales)的一科，在我国有7属11种，自生有腺果藤属(Pisonia)、黄细心属(Boerhavia)等植物，引种的有叶子花(B.spectabilis)和光叶子花[9]。现有的园艺品种多为光叶子花、叶子花和秘鲁叶子花(B.peruviana)3个原种及其杂交和变异的后代，此3种已成为栽培品种主要的育种亲本[10-11]。目前，紫茉莉科植物的研究主要集中在资源调查[12-13]、组织培养[14-15]、药用价值[16]、形态学研究[17]等方面，此外Yuan等[18]研究了药用植物喜马拉雅紫茉莉(Mirabilishimalaica)叶绿体基因组的完整序列。邱胤晖利用生物信息学技术，阐明了三角梅苞片色泽形成和成花的分子机制[19]。张玲玲利用分子标记技术，为三角梅的品种分类和种质资源的保护提供了技术支持[20]。孙利娜等[21]基于ISSR分子标记构建了叶子花亲缘关系分析和指纹图谱，为品种鉴定及遗传多样性提供了有力支撑。Wang等[22]对西藏(山南和林芝)和四川(甘孜)的喜马拉雅紫茉莉3个样本进行了完整的叶绿体基因组测序，并与其他几种紫茉莉科植物进行了系统发育关系的研究，结果显示此3种互为姐妹类群，且和紫茉莉聚在同一支上，支持率为100%。另外，紫茉莉科叶子花属植物的系统发育关系图表明同属植物支持率更高[23]。这些都为紫茉莉科甚至石竹目植物的分类提供了理论支撑。本研究利用生物信息学手段对紫茉莉科9个种的叶绿体基因组进行特征分析，结果可为紫茉莉科植物的系统进化关系研究和物种鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

从NCBI数据库中下载已公布的石竹目12个种的叶绿体基因组序列用作分析，其中9个种为紫茉莉科，2个种为石竹科(Caryophyllaceae)，1个种为苋科(Amaranthaceae)。GenBank登录号分别为：MN449976光叶子花(B.glabra)；MN315508叶子花(B.spectabilis)；MT407463秘鲁叶子花(B.peruviana)；MW123902厚叶子花(B.pachyphylla)；MW123903(B.hybrid)；MN711726黄细心(Boerhaviadiffusa)；MH286318夜茉莉(Nyctaginiacapitata)；MH286321(Acleisanthesobtusa)；MN548769喜马拉雅紫茉莉(M.himalaica)；JF715055叉枝蝇子草(Silenelatifolia)；NC035226头序蝇子草(S.capitata)；MG836505千穗谷(Amaranthushypochondriacus)。

1.2 叶绿体基因组序列比对分析

在Genious软件中打开这12个目标序列，以光叶子花的近缘种植物秘鲁叶子花为参考序列进行比对分析。在Geneious中校正注释信息后，于MAFFT软件进行序列比对，再进行手工校对，保存结果用于后续分析。将光叶子花的GenBank格式文件用DRAW Organel Genome Maps(OGDRAW)在线绘图工具绘制出叶绿体基因组物理图谱，并作叶绿体基因组注释基因信息表。

1.3 简单重复序列分析

采用MISA软件对紫茉莉科9个种的叶绿体基因组序列进行微卫星分析，参数设置为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数分别为10、6、5、5、5和5[24]。

1.4 IR区边界的收缩与扩张分析

利用IRSCOPE(https://irscope.shinyapps.io/irapp/)在线软件，分析比较紫茉莉科9个亲缘物种的IR边界区的基因类型和基因分布情况，看是否存在明显的收缩和扩张。

1.5 核酸多态性及系统发育关系分析

使用Dnasp V6软件计算紫茉莉科9种植物间的核苷酸多态性值(pi值)，窗口长度设为600 bp，步长设为200 bp；通过之前比对的数据，以JF715055叉枝蝇子草、NC035226头序蝇子草和MG836505千穗谷为外类群，使用最大似然法(ML)构建系统发育树，将12条比对好的序列的.fasta格式文件用Geneious软件转化成.phy格式文件，将.phy文件放入iqtree软件中，计算得到GTR+F+R2的模型建树，再在figtree软件中编辑树。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组基因比较

光叶子花，NCBI登录号为MN449976，基因组大小为154 763 bp，平均GC含量为36.4%，由表1可知，紫茉莉科9个种的叶绿体基因组长度在152 995～154 763 bp之间，它们都呈典型的四分体结构，LSC区长度在83 700～88 100 bp之间，SSC区长度在17 785～18 078 bp之间，IR区长度在24 171～26 207 bp之间，虽然它们长度不同，但基因数量和蛋白编码数量相差无几，rRNA和tRNA基因数相同(表1)。

表1 紫茉莉科9种植物叶绿体基因组比较

其中，光叶子花叶绿体基因组共有131个基因，86个蛋白质编码基因，8个rRNA基因和37个tRNA基因(表2)。其中，18个含有两份拷贝基因，是4个rRNA基因(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)、7个tRNA基因(trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnR-ACG、trnA-UGC、trnN-GUU、trnV-GAC)和7个蛋白编码基因(rps7、rpl23、rps12、ndhB、rpl2、ycf1、ycf2)。除此外还有21个基因含有内含子，18个基因含有1个内含子，包括6个tRNA基因(trnI-GAU、trnA-UGC、trnV-UAC、trnL-UAA、trnG-UCC、trnK-UUU)，8个蛋白编码基因(ndhB、ndhA、rpl16、petD、petB、rpoC1、atpF、rps16)；3个基因(clpP、rps12、ycf3)则含有2个内含子。其中trnI-GAU、trnA-UGC、ndhB为具有1个内含子的双拷贝基因，rps12为具有2个内含子的双拷贝基因(图1)。

表2 光叶子花叶绿体基因组注释基因信息

2.2 紫茉莉科9个种简单重复序列分析

利用MISA软件分析可得，紫茉莉科9个种的叶绿体基因组中检测到605个SSR位点，重复类型最多的是单核苷酸共582个，(A有218个、T有354个、G有10个)，二核苷酸有20个(AT有4个、TA有16个)，三核苷酸有3个(ATA、AAT、TTA，各为1个)，没有发现四核苷酸及以上的重复类型，占SSR的总数分别为：96.2%、3.3%、0.5%。共有4种重复基元，其中优势基元是A/T，有572个，其次是AT/AT，20个，C/G，10个，AAT/ATT，3个，分别占SSR总数的94.5%、3.3%、1.7%和0.5%(图2)。

2.3 紫茉莉科9个种叶绿体基因组IR边界的收缩与扩张分析

选取紫茉莉科9个种的叶绿体基因组进行比较，分析光叶子花的IR边界的收缩与扩张情况，见图3。

由图3可知，除了黄细心和叶子花以外，其余7种的LSC/IRb边界位于rps19基因编码区，如光叶子花、厚叶子花、秘鲁叶子花的rps19基因越过LSC/IRb边界114 bp；喜马拉雅紫茉莉、夜茉莉的rps19则越过29 bp和128 bp。在IRb/SSC边界处，ndhF基因位于边界靠近SSC侧，光叶子花的ndhF基因越过边界向IRb延伸了21 bp，其余大多延伸数值相同。在所有叶绿体基因组的IRb区域中，部分ycf1的拷贝与ndhF基因重叠。有8个种的ycf1片段在IRb/SSC边界处有2 bp或4 bp的小延伸。SSC/IRa边界常位于ycf1编码序列中，光叶子花的ycf1越过边界1 371 bp，其余略微有所差异。另外，trn-GUG常位于IRa/LSC的LSC一侧，光叶子花距边界22 bp，B.hybrid也距边界22 bp，其余相近的秘鲁叶子花、厚叶子花距离边界17 bp。以上分析结果表明，紫茉莉科不同物种的叶绿体基因组IR边界区的基因类型和基因分布情况存在一定差异，但相对比较保守。

2.4 紫茉莉科9种植物间的核苷酸多态性分析

用Dnasp V6软件计算紫茉莉科9种植物间的核苷酸多态性值(pi值)，结果表明9个叶绿体基因组之间的pi值在0～0.107 59之间，平均值为0.024 03。pi>0.07时，检测到6个高变区。其中LSC区检测到4个：rps16-trnQ、rps4-trnL、ndhC-trnV、rps3-rpl22，SSC区检测到2个：ndhF-rpl32、ycf1(图4)。

2.5 系统发育分析

12种植物的叶绿体基因组系统发育分析结果见图5。

由图5知，外类群植物先被分离出来，其余的9种植物聚到2个进化枝，叶子花属的5个物种形成的分支形成姐妹关系，其中叶子花(登录号：MN315508)及其栽培种B.hybrid(登录号：MW123903)和光叶子花(登录号：MN315508)、秘鲁叶子花(登录号：MN315508)和厚叶子花(登录号：MN315508)互为姐妹类群，支持率都为100%。另一进化枝上的Acleisanthesobtusa植物先被分离出来，其余夜茉莉、黄细心和喜马拉雅紫茉莉3个物种形成的分支形成姐妹关系。

3 讨论

通过对12种植物的叶绿体基因组结构的比较发现，基因组长度从150 224 bp到154 763 bp，其基因结构与基因内容较为保守，它们编码130个左右的基因(84～86个蛋白编码基因，37个tRNA基因，8个rRNA基因)。IR区域重复的基因基本相同，有7个tRNA基因(trnl-CAU、trnV-GAU、trnL-CAA、trnA-UGC、trnl-GAU、trnR-ACG、trrN-GUU)、4个rRNA(rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23)、7个蛋白编码基因(rps7、rp12、rps12、rpl23、ycf2、ndhB、ycf1)。其中LSC区的蛋白编码基因accD在2个属中丢失了，这可能是由于蛋白编码基因的数量不同所导致的[25]。其中两个基因ycf3和clpP含有2个内含子，这与大部分被子植物叶绿体基因组相同[26]。总体来说，紫茉莉科叶绿体基因组结构和特征基本相似，没有观察到基因顺序或基因含量的显著变化，这与Bautista等[25]在叶子花属植物叶绿体基因组全序列的比较分析中的结果相一致。

简单重复序列(SSR)在植物叶绿体基因组中分布广泛，信息含量大，具有高多态性，叶绿体基因组SSR以其独特的母系遗传优势被利用于鉴定亲缘关系和系统发育研究中[27-28]。它还是一种高效的分子标记，有标记数量丰富、重复性高及共显性遗传、相对保守等优点，因此广泛应用于群体水平的遗传差异分析和物种鉴定[29-30]。通过对紫茉莉科9个种的叶绿体基因组SSR分析发现，共有605个SSR位点，重复类型最多的是单核苷酸，优势重复基元是A/T，未检测到四核苷酸及以上的重复类型，但在Bautista等[25]的研究结果中，显示单核苷酸和A/T丰富，不同的是其还检测到了四核苷酸和五核苷酸，重复基元的类型也丰富些，造成些许差异的原因可能是SSR分析时在参数设置上有所不同，其设置的四核至六核苷酸重复数分别为3次。

IR区域的伸缩与扩张在演化过程中起重要的作用[31-32]，可引起叶绿体基因组的大小变化。本研究中光叶子花的rps19基因向IRb延伸了114 bp，ycf1片段在IRb/SSC边界处有2 bp的小延伸，在SSC/IRa边界ycf1越过边界1 371 bp，这些都与Bautista等[25]的研究结果一致。可见，光叶子花和其他同科植物的叶绿体基因组IR边界收缩与扩张还是存在差异的，但还是相对保守的。和同属植物之间比较不同的是，序列都属于同一属，偏移相对较小。

9个叶绿体基因组之间检测到6个高变区，LSC区和SSC区的pi值明显高于IR区，这可能与IR区域进化的保守性有关[33]。其中蛋白编码区ndhF、ycf1，非编码区rps16-trnQ作为高可变区域在其他植物中也有报道，它们被认为是潜在的分子标记[34-35]。SSC区检测到的2个高变区ndhF-rpl32和ycf1与Bautista等[25]的研究结果一致。基于叶绿体基因组的石竹目系统发育树分析发现，构成的分支支持率均达100%，叶子花和B.hybrid处于同一分支上，B.hybrid其实是原产于印度的一个栽培品种，且这一分支又与光叶子花处于同一分支；秘鲁叶子花和厚叶子为姐妹类群。根据之前的序列分析，我们可以观察到这几个种的序列差异较小，都属于叶子花属，因此在系统发育树中关系也更接近。Bautista等[25]对叶子花属植物系统发育分析的研究中也是认为叶子花及其变种与光叶子花的亲缘关系更近。在光叶子花的叶绿体基因组研究中其与叶子花互为姐妹类群，二者关系更近[23,36]。在叶子花植物的叶绿体基因组系统进化关系的研究中，叶子花和番杏科(Aizoaceae)的番杏(Tetragoniatetragonoides)和冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)两种植物聚在同一分支中，支持率为100%，苋属(Amaranthus)、蝇子草属(Silene)还有南漆姑属(Colobanthus)中各自的2个物种互为姐妹类群,不同科间的植物在一个大的进化枝上，支持率均为100%[37]。而在喜马拉雅紫茉莉叶绿体基因组系统进化关系中，支持率95%的进化枝下，叶子花和紫茉莉属植物夜茉莉和喜马拉雅紫茉莉互为姐妹关系。番杏科的番杏和冰叶日中花聚在一支，支持率为100%，且和紫茉莉科的其他植物聚在一个大的进化枝下，支持率为100%[18]。可见，研究者为了更好地探究叶子花和紫茉莉在紫茉莉科中的系统发育位置，对石竹目不同科植物间的叶绿体基因组序列进行了比对分析，其结果显示同属植物更多的互为姐妹类群，亲缘关系近，但同目不同科间支持率也基本为100%，该结果也说明石竹目植物间系统进化可信度较高。本研究只是基于紫茉莉科植物的系统发育分析，叶子花属、紫茉莉属等都能聚在同一分支下，这与上述研究结果基本一致。

致谢：本研究光叶子花叶绿体基因组序列自NCBI数据库下载，特此感谢Ni等作者。