新鞘氨醇单胞菌预处理对木材结构及酶解的影响∗

曹舒祺 陈梦婕 侯贤锋 孙 瑾

（华南农业大学材料与能源学院，广东 广州 510642）

木质纤维素是重要的再生资源，对于缓解能源紧缺压力和解决环境污染问题有重要意义[1-2]。然而，木质纤维素具有独特的保护性壁垒结构[3-4]，阻碍了其生物质转化过程，因而难以直接利用。因此，需要通过物理法、化学法和微生物法[5]对木质纤维素进行预处理。物理法主要是减小样品颗粒尺寸，改变木质原料的结构，不会去除非纤维素部分（木质素和半纤维素等），且所需能耗和成本较高[6-7]。化学法主要是通过化学试剂破坏木质素和半纤维素的结构，从而暴露出纤维素，增加其可及性。然而，化学处理不仅会污染环境，还会产生副产物，抑制后续发酵过程[8-9]。

微生物法是一种环保、温和且低成本的预处理方法[10-11]，可以有效避免物理法和化学法存在的问题，具有良好的应用前景。微生物法主要包括真菌预处理和细菌预处理两种方式[12-13]。相比于真菌，细菌生长迅速，具有良好的环境适应能力，生长过程对pH和温度要求较低，同时可产生多种酶，增强预处理效果[14]。目前，用于预处理的细菌有梭菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、新鞘氨醇杆菌属等[15-19]。Bahiru等[20]从白蚁体内分离出水稻苍白杆菌 BMP03 和芽孢杆菌 BMP01，用于稻草秸秆的预处理，发现木质素去除率可达53.74%，还原糖产量提高了69.96%。目前，细菌预处理研究主要集中于稻草秸秆[20-21]和玉米秸秆[1,17]等农业废弃物，对木材结构及酶解效果的影响尚不清楚。

本研究采用新鞘氨醇单胞菌分别对针叶材（马尾松）和阔叶材（尾叶桉）进行处理。通过化学成分分析、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析、X射线衍射（XRD）分析、扫描电子显微镜（SEM）观察、水解糖化测试，研究新鞘氨醇单胞菌预处理对两种木材化学结构、微观形态、酶解效率等的影响，以期为细菌预处理木材研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

尾叶桉（Eucalyptus urophylla）和马尾松（Pinus massoniana）木粉购自广东省云浮市。将木粉在90 ℃的条件下烘干8 h，而后经行星式球磨机热磨，用分筛机分选200目样品备用。新鞘氨醇单胞菌（Novosphingobiumsp.）购自广东省微生物保藏中心，序列号为GIM 1.338。本试验中所用化学试剂均为分析纯。

Spectrum 100 傅里叶变换红外光谱（PerkinElmer，美国），Ulitma IV X射线衍射仪（Rigaku，美国）S-570 扫描电子显微镜（Zeiss，德国），UV-5800 紫外分光光度计（上海元析），DGL-35B高压灭菌锅（上海力辰），pHS-3C pH计（上海仪电）。

1.2 菌种培养

在30 ℃，120 r/min的摇床中进行新鞘氨醇单胞菌的培养，所用的培养基为溶菌肉汤培养基（LB）和牛肉膏蛋白胨培养基，预处理试验所用的培养基为无机盐培养基。其中，LB培养基的成分为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸馏水1 L。牛肉膏蛋白胨培养基的成分为：牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，蒸馏水1 L。无机盐培养基为：(NH4)2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.1 g/L，FeSO40.05 g/L，MnSO40.02 g/L，KH2PO41 g/L，蒸馏水1 L。上述培养基均用1 M的NaOH溶液调pH值至7.0～7.2。在温度为121 ℃的高压灭菌锅内灭菌20～30 min。将新鞘氨醇单胞菌接种到灭菌的LB培养基中，在温度为30 ℃，转速为120 r/min的摇床内培养18 h后，用紫外分光光度仪测定600 nm处菌液的光密度值（OD），待菌液的OD值达到1.0时，可用于预处理试验。

1.3 细菌预处理

在500 mL的三角瓶内配制200 mL的无机盐培养基，将pH调至7.0～7.2。分别称取2 g的尾叶桉和马尾松木粉，装入离心管中，放入高压灭菌锅内灭菌。待无机盐培养基冷却至室温时，取20 mL OD值达到1.0的菌液，加入含有木粉的无机盐培养基中。放入温度为30 ℃，转速为120 r/min的摇床内，待第5 d时取出，用于后续测试和分析。

1.4 酶促水解

称取处理过和未处理的木粉各0.1 g，纤维素酶30 mg，20 mL pH为4.8的柠檬酸钠缓冲液。放入温度为50 ℃，转速为150 r/min的摇床内，72 h后取出，用3,5-二硝基水杨酸法 （DNS） 测糖产量。

1.5 分析方法

1.5.1 化学成分分析

采用范式洗涤法测量样品的纤维素、半纤维素和木质素含量。即用酸性洗涤剂和中性洗涤剂洗涤样品获得酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）。将ADF经5 mL 72%硫酸溶液酸浸3 h，而后加入45 mL蒸馏水过夜，即获得酸不溶木质素（ADL）。将ADL在550 ℃马弗炉内烧制2.5 h，即可获得灰分。上述NDF和ADF的差值，ADF和ADL的差值，ADL和灰分的差值分别为半纤维素、纤维素和木质素的含量。

1.5.2 FT-IR测试

采用FT-IR观察处理前后木粉化学结构的变化。将待测样品和KBr粉末按1∶100的比例混合均匀，压制成片后进行扫描，波长范围4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.5.3 XRD测试

采用XRD观察处理前后木粉的结晶度变化，扫描范围10°～45°，扫描速度8°/min。结晶度（CrI）计算按照Segal公式计算：

式中：I002为2θ=22.48°的强度值；Iamp为2θ＝18.50°的强度值。

1.5.4 SEM表征

采用SEM观察处理前后木粉样品表面微观结构的变化。测试前，需要对样品进行喷金处理，以免测试过程对样品表面结构造成损伤。

2 结果与分析

2.1 化学成分分析

如表1所示，经过新鞘氨醇单胞菌处理后，两种木材的木质素含量均降低。这是因为新鞘氨醇单胞菌通过降解木质素将其作为自身生长所需的碳源，同时对木质素产生一定的矿化作用[22]。木质素含量的降低意味着纤维素表面的保护壁垒降解，这将有利于提高纤维素的可及性，从而增强其酶解效率。经计算，预处理后，尾叶桉的木质素含量下降了13.6%，而马尾松木质素含量仅下降了6.4%，表明新鞘氨醇单胞菌对阔叶材预处理效果高于针叶材。

表1 预处理前后尾叶桉和马尾松样品中主要化学成分Tab.1 The chemical composition of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.2 FT-IR分析

图1为处理前后马尾松和尾叶桉木粉的红外光谱图。预处理前，两种树种显示出不同的特征峰，主要源于其木质素结构差异[23]。细菌预处理后，这两种树种的特征峰变化显著且较为相似。

图1 处理前后尾叶桉和马尾松FT-IR图谱Fig.1 The FT-IR spectra of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

由图1可知，经新鞘氨醇单胞菌处理后，木质素的特征峰强度明显降低。如3 400 cm-1代表羟基中O--H的伸缩振动[24]，该处特征峰强度降低，表明木材中部分木质素和多糖被降解。1 650、1 507 cm-1和1 460 cm-1处特征峰分别代表具有芳香结构的共轭木质素侧链上烷基的C==O，芳香环骨架C==C的伸缩振动和紫丁香基基团的甲基和亚甲基的变形[25]。经过预处理后，这些特征峰强度均有所减弱，表明木质素的结构发生了变化。也就是说，细菌预处理破坏了木质素的化学结构。木质素结构的破坏有利于削弱木质素对纤维素的保护作用，促进纤维素酶的进入，从而提高酶解效果。值得注意的是，由图1可知，预处理的尾叶桉在1 375 cm-1（表示愈创木基和紫丁香基的缩合，以及紫丁香基CH2弯曲振动[21,26]）处的特征峰强度减弱，这种情况在马尾松的红外图谱中并不明显。这表明，新鞘氨醇单胞菌预处理对尾叶桉中木质素的破坏更严重，这与化学成分分析结果一致。

2.3 XRD分析

在XRD衍射谱中，22.48°被视为I002晶面，18.50°被视为无定形区。由图2可知，两种木材预处理前后的XRD峰形均未发生明显变化。通过计算可知，尾叶桉的结晶度为55.34%，预处理后结晶度上升至56.49%；马尾松的结晶度为47.68%，预处理后结晶度上升至53.52%。结晶度的增加是由于细菌预处理去除了无定形部分（木质素），使得结晶纤维素的比例相对增大[27-28]。这表明新鞘氨醇单胞菌预处理破坏了针叶材（马尾松）和阔叶材（尾叶桉）的非结晶区。

图2 预处理前后尾叶桉和马尾松X射线衍射图谱Fig.2 The XRD pattern of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.4 SEM分析

如图3所示，预处理后两种木材的形态和显微结构都发生了变化。处理前，两种木材样品的表面均呈现连续、平整的形态（图3a、c），而在预处理后木材样品表面可观察到孔洞、沟槽等明显的形态变化（图3b、d）。这主要是因为细菌预处理降解并矿化了部分木质素，导致原本光滑连续的表面出现了许多裂纹，使包裹于其中的纤维素暴露[22]。此外，通过对比处理后的马尾松和尾叶桉样品，可以发现，尾叶桉的表面破损更为严重（3b、d），这与上述的成分分析和FT-IR的结论一致。

图3 预处理前后木材样品扫描电镜图Fig.3 The SEM of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

2.5 酶解效果

为探讨新鞘氨醇单胞菌预处理对这两种木材的酶解效果的影响，对预处理前后的尾叶桉和马尾松进行了酶促水解糖化研究，结果如表2所示。未处理尾叶桉产生的还原糖为186.4 mg/g，预处理后还原糖为236.5 mg/g。马尾松预处理后，其还原糖产量从287.9 mg/g增加到315.1 mg/g。这说明，预处理后针叶材和阔叶材的酶促水解效果均得到提高。根据计算，预处理后尾叶桉和马尾松的还原糖产量分别提高了26.9%和9.4%。可见，新鞘氨醇单胞菌预处理对尾叶桉的作用效果更加明显，使其微观结构破坏更严重，从而使得尾叶桉的酶解效果提升更为显著。

表2 预处理前后木材样品的糖转化率Tab.2 The reduce sugar yield of wood sample before and after pretreatment

3 结论

本研究采用新鞘氨醇单胞菌处理针叶材和阔叶材样品，分析了预处理前后木材的化学结构、微观形态及酶解效率变化。结果表明，预处理后两种木材的木质素结构均被破坏，致使木材的结晶指数增大，同时木材表面出现裂纹、孔洞、沟槽等现象，增加了纤维素的可及性，从而提高了木材的酶解效果。相对于针叶材，新鞘氨醇单胞菌预处理对阔叶材的木质素及微观结构破坏更为明显。本研究可为木材的细菌预处理提供参考。