基于网络药理学与分子对接探讨川楝子治疗痛经的作用机制*

杨睿，张伟

1.上海市浦东新区光明中医医院，上海 201399； 2.上海市浦东新区卫生健康委员会监督所，上海 200135

川楝子为楝科植物川楝的干燥成熟果实，具有舒肝行气止痛、驱虫的功效[1]，临床上在妇科疾病中应用甚广，特别是治疗痛经效果显著[2-9]。川楝子的主要化学成分为萜类成分，其中，川楝素被认为是川楝子的主要药效物质基础和毒性成分[10-13]。研究发现，川楝子有镇痛、抗炎、抗菌、抗肉毒素及抑制肿瘤细胞生长等作用[14-17]，同时具有肌无力、抑制呼吸中枢及肝肾毒性等不良反应[18-20]。现在临床多将其炮制后及联合其他药物入药，已达到“减毒增效”的作用[20-23]。本研究通过处方分析、网络药理学及分子对接技术探讨其治疗妇科痛经的物质基础及作用机制，以期为其临床应用提供理论依据。

1 方法

1.1 川楝子处方分析调取上海市浦东新区光明中医医院的信息系统数据：2015年11月1日至2020年10月31日期间每月全院随机抽查的100份中药处方，全年共计6 000张处方。将数据录入，挑选其中含川楝子的中药处方1 770张，对患者性别、开处方科室、处方主治疾病等进行分析。

1.2 川楝子活性成分及作用靶点的获取通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库(http：：//Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)筛选川楝子的活性成分，以口服利用度(oral bioavailabity，OB)≥10%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为筛选条件。将结果输入汇集Targetbank、Drugbank、 BindingDB和PDTD四大数据库的Pharmmapper数据库(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，Select Targets Set 项选择Human Protein Targets Only(v2010，2241)，Number of Reserved Matched Targets输入100，其余参数均为默认，获得川楝子作用靶点。

1.3 痛经靶点的获取及活性成分-痛经直接靶点网络构建将痛经设置为关键词输入GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)，获得该疾病相关靶点。再与川楝子作用靶点取交集，获得川楝子治疗痛经的直接靶点。将结果导入Cytoscape 3.8软件构建川楝子治疗痛经的活性成分-直接靶点网络。

1.4 蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)网络分析及GO功能富集分析、KEGG通路富集分析将直接靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org/)，限定物种为“Homo sapiens”，置信度设为≥0.4，获取靶点PPI、GO生物功能和KEGG通路富集的信息，将其中PPI数据导入Cytoscape 3.8软件进行可视化分析。

1.5 核心成分与核心靶点的分子对接使用分子对接方法，先在 TCMSP 数据库下载核心成分的结构保存为 mol2 格式。从 PDB 数据库(https：//www.rcsb.org/)筛选分辨率高、最新上传的核心靶点蛋白的结构*PDB 格式并下载，用PyMOL软件对蛋白质和化合物进行去水、加氢等操作，运用Auto Dock1.5.6 软件将其均转换为*pdbqt 格式并确定盒子大小，运行 Vina 进行对接，最后用 PyMOL 软件可视化结果。

2 结果

2.1 含川楝子处方临床应用规律2015年11月至2020年10月，6 000张中药饮片处方中含川楝子的1 770张，占总处方29.5%。在这些处方中，女性患者占比83.05%。图1(A)反映的是含川楝子处方应用科室情况，妇科、消化内科、肛肠科三个科室占比总和高达87.57%。主治疾病共27种，频数排名前5名的主要疾病如图1(B)所示，占总处方的83.6%，其中，最高的为痛经，占32.19%。

2.2 川楝子的活性成分、作用靶点TCMSP数据库记载的川楝子33个成分中经筛选条件后得到14个有效成分：苦楝子酮、豆甾醇、罗汉柏二烯、印楝波力定C、皮树脂醇、印楝波力定D、蜂花酸、正三十醇、川楝素、蛇菰宁、印楝波力定A、槲皮素、亚麻酸乙酯、甘露醇，在pharmmapper数据库得到的作用靶点去重合并后共305个。经分析痛经靶点共301个，与川楝子活性成分的作用靶点取交集得到20个治疗痛经的直接靶点，Venn图见图2(A)。将14个活性成分、20个直接靶点导入Cytoscape3.8软件构建川楝子治疗痛经的活性成分-靶点网络，见图2(B)，图中共34个节点，131条边，其中菱形代表成分，圆形代表靶点，每个成分平均与9.36个靶点相互作用，每个靶点平均与6.55个成分相互作用，体现川楝子治疗痛经多成分、多靶点共同作用的机制。其中成分(正三十醇、川楝素、印楝波力定D、苦楝子酮)因均能与11个靶点连接、排名最前而在整个网络中起关键作用。

注：A：川楝子科室处方量；B：川楝子处方病种占比图1 川楝子处方临床应用规律

A：Venn图；B：活性成分-靶点网络图图2 川楝子活性成分-直接靶点网络

2.3 川楝子的直接靶点PPI分析20个直接靶点在置信度≥0.4的条件筛选下，共产生20个节点、59条边，每个靶点平均与5.9个靶点有相互作用。其中靶点EGFR、ESR1、CASP3的节点度≥10，依次为14、12、11。其中圆形代表靶点，圆的大小、颜色深浅与节点度的高低成正比，见图3。

2.4 川楝子直接靶点的GO生物功能和KEGG通路分析选取GO生物功能分析按综合排名各前5条生物过程、分子功能、细胞成分，与综合排名前5条KEGG通路富集的结果进行分析，结果见表1。其中，内分泌抵抗和雌激素信号通路与治疗痛经关联较大。

2.5 分子对接验证川楝子治疗痛经的核心成分与靶点的结合作用结合高节点度靶点和KEGG通路的功能信息，ESR1(雌激素受体α)有可能在川楝子治疗痛经中发挥重要作用。在PDB数据库中挑选ESR1蛋白列表中解析方法为“X-RAY DIFFRACTION 1.8 Å”。2021年1月20日上传数据库、人源的6ZOQ号结构为受体，苦楝子酮、川楝素、正三十醇、印楝波力定D的小分子结构作为配体，两两进行分子对接。分子对接示意图和具体相互作用的氨基酸展示见图4。各组分子对接结合能、pharmmapper数据库预测靶点 z′score 分数、口服利用度、类药性的信息见表2。

图3 川楝子治疗痛经直接靶点的相互作用

表1 川楝子治疗痛经直接靶点的GO生物功能和KEGG通路分析

注：A：苦楝子酮；B：川楝素；C：正三十醇；D：印楝波力定D图4 ESR1与川楝子治疗痛经核心化合物的分子对接图

表2 川楝子治疗痛经核心成分的药动学参数及其与 ESR1 的结合数据

3 讨论

痛经为最常见的妇科疾病之一，通常伴随腰痛、腹痛等症状，以难治愈、需长期持续治疗为特点，国内外学者研究发现，其发生可能与子宫、内分泌、精神等有关[24]，但迄今为止尚无统一意见。根据文献报道与我们的处方分析结果，川楝子用于治疗妇科痛经病历史悠久，效果显著，中医药治疗痛经的处方中与延胡索、香附等配伍，共奏行气止痛之功，但是其治疗妇科痛经的物质基础及作用机制均尚未明确。

通过网络药理学方法发现，305个川楝子作用靶点中有20个为文献报道过的与痛经相关的靶点，故推测这20个靶点为川楝子治疗痛经的直接靶点，并据此开展活性成分——直接靶点网络、PPI、GO功能和KEGG通路富集等生物信息学分析。在活性成分-直接靶点网络中，4个成分(正三十醇、川楝素、印楝波力定D、苦楝子酮)均能与11个靶点连接、排名最前在整个网络中起关键作用，故推测其为核心成分。在直接靶点PPI网络中，有3个靶点(EGFR、ESR1、CASP3)相互作用节点度大于10。其中，表皮生长因子受体在许多上皮组织源性肿瘤上高表达，是一种重要的肿瘤标志物[25]。CASP3是半胱氨酸肽酶3，参与蛋白水解、细胞凋亡的过程。而ESR1是雌激素受体α，一种配体激活的转录因子，可与雌激素受体2形成同二聚体或异二聚体，对性发育和生殖功能至关重要。由于女性月经周期本就由雌激素分泌参与调控，痛经与雌激素的关联不言而喻，故推测其是川楝子治疗痛经的核心靶点。KEGG通路富集排名前五的通路发现，内分泌抵抗通路的核心是雌激素类药物，与乳腺疾病相关，对应的川楝子靶点为MMP2、EGFR、ESR2、MMP9、ESR1、MDM2。而雌激素信号通路主要通过雌激素与受体结合而发挥作用，在雌性第二特征维持、乳腺癌等发生发展中有重要作用，对应的川楝子靶点为MMP2、EGFR、ESR2、MMP9、ESR1、NOS3。2条信号通路的功能和靶点高度重合，与痛经、雌激素均紧密相关，且核心靶点ESR1均在其中，故推测川楝子可能通过调控ESR1参与这2条通路来治疗痛经。

从分子结构角度验证4个核心成分与治疗痛经核心靶点ESR1的关系。分子对接结果中结合能小于0，说明配体与受体可以自发结合，数值越低证明亲和力越大。z′score是pharmmapper数据库中结合了分子拟合分数和文献数据库现有资料的算法分数，数值大小与其是靶点的可能性成正比，范围一般在0.5～2.5。OB是重要的药动学参数之一，表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，值越高通常表示药物的生物活性分子越好。DL指化合物与已知药物的相似性，值越高意味着具有成为药物的可能性越大。本研究的结果提示，ESR1与4个核心成分均有结合位点，初步验证了我们的猜想，其中苦楝子酮的亲和力最大。其他3个药动学参数结果中，苦楝子酮以1.33的z′score、40.73%的口服利用度、0.81的类药性表现出有成为治疗痛经药物的潜力。苦楝子酮是来源川楝子、苦楝子的黄酮类成分，有学者发现其能抑制黄病毒、沙门氏菌等[26-27]，尚无关联痛经的报道。

综上所述，本研究通过处方分析、网络药理学和分子对接结果发现，川楝子广泛应用于治疗妇科痛经。检索筛选出14个川楝子活性成分、20个治疗痛经直接靶点，活性成分-靶点网络包含34个节点与131条边，直接靶点PPI网络包含20个节点与59条边。其中，川楝素、苦楝子酮、正三十醇、印楝波力定D为核心成分，ESR1为核心靶点。KEGG富集分析出川楝子治疗痛经与内分泌抵抗、雌激素这2条信号通路有关。分子对接提示苦楝子酮与ESR1结合活性最佳，首次预测苦楝子酮与ESR1、内分泌抵抗通路的关系，为阐释川楝子治疗妇科痛经的机制提供理论基础。