基于网络药理学探讨桂枝茯苓丸治疗冠心病的作用机制

代泽阳

成都市龙泉驿区中医医院，四川 成都 610100

冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)，该病的发生进展涉及多种危险因素，因此需联合运用抗血小板、稳定斑块、拮抗心肌重构、调节心肌能量代谢等药物策略进行防治[1-2]。中医学将冠心病归属于“胸痹心痛”范畴，本虚标实贯穿疾病的始终，本虚以气虚、阴虚为主；标实以血瘀、痰浊、气滞多见[3]。

中医经典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍等组成，载于张仲景的《金匮要略》，《金匮要略·妇人杂病脉证并治》曰：“妇人宿有癥病，经断未及三月……当下其癥，桂枝茯苓丸主之。”方中桂枝温经通脉，茯苓健脾祛痰，牡丹皮凉血活血，桃仁活血祛瘀，赤芍散瘀止痛。诸药合用，共奏温经、通络、活血、化瘀、消癥之功，临床多用于治疗子宫肌瘤、卵巢囊肿、子宫内膜异位症、盆腔炎、痛经、前列腺增生等疾病[4]。

基于中医异病同治、治病求本理论，有文献报道桂枝茯苓丸能改善心肌微循环，治疗冠心病疗效确切[5-7]。但桂枝茯苓丸治疗冠心病的机制研究较少，本文运用网络药理学方法探讨桂枝茯苓丸治疗冠心病的作用机制，为后续深入研究提供参考和依据。

1 方法

1.1 收集桂枝茯苓丸有效成分及靶点基因通过检索中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com/index.php)收集桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍已知成分。在检索结果中以口服利用度[8](oral bioavailability，OB)≥30%、类药性[9](drug-likeness，DL)≥0.18为条件，筛选出桂枝茯苓丸的有效成分。在TCMSP中对上述结果进行搜索匹配，得到有效成分的靶点蛋白，将靶点蛋白输入Uniprot(https：//www.uniprot.org/)数据库，并将种属选为“Homo sapiens”，检索得到桂枝茯苓丸的标准靶点基因。

1.2 桂枝茯苓丸治疗冠心病潜在靶点的筛选以关键词“coronary heart disease”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库中进行检索，获取冠心病相关靶点并加以整理。将桂枝茯苓丸靶点和冠心病靶点导入Draw Venny Diagram在线程序(http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集获得药物与疾病共同靶点，此集合为桂枝茯苓丸治疗冠心病的潜在靶点。

1.3 药物-成分-靶点网络图绘制将桂枝茯苓丸有效成分、潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件绘制药物-成分-靶点网络图。其中节点(node)代表药物、有效成分、潜在靶点；边(edge)连接药物、有效成分与靶点，展现相互作用关系。

1.4 核心网络分析运用Cytoscape 3.7.2软件中Bisogenet、CytoNCA插件对潜在靶点构建蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)网络分析、拓扑分析，构建核心网络，经筛选得到核心靶点，以分析桂枝茯苓丸有效成分治疗冠心病的作用靶点。

1.5 GO功能和KEGG富集分析将核心靶点导入Hiplot在线作图工具(https：//hiplot.com.cn/advance/clusterprofiler-go-kegg)，以P<0.05为条件进行GO功能、KEGG通路富集分析，其中GO功能分析包括生物进程(biological process，BP)、细胞组分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)。用气泡图形式展示分析结果，以探究桂枝茯苓丸治疗冠心病可能的作用机制。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸的有效成分、靶点基因收集和整理在TCMSP中检索桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍的有效成分，根据OB≥30%和DL≥0.18为条件进行筛选，去重后得到包含作用靶点的有效成分43个，见表1。将有效成分对应靶点蛋白通过Uniprot数据库转换为人类基因名，经去重后共获得210个标准靶点基因。

2.2 桂枝茯苓丸治疗冠心病潜在靶点筛选在GeneCards数据库中检索关键词“coronary heart diseases”，共得到7 100个相关基因。使用Draw Venny Diagram在线程序将冠心病相关且关联分数≥19.71共889个基因，与桂枝茯苓丸210个靶点基因取交集，最终获得89个潜在靶点，见图1。

2.3 药物-成分-靶点网络构建使用Cytoscape 3.7.2软件绘制桂枝茯苓丸治疗冠心病“药物-成分-靶点”网络图，其中包含284条边、126个节点，见图2。度值越大，节点形状越大、作用越关键，该图直观反映了桂枝茯苓丸是通过多成分、多靶点治疗冠心病。本研究结果发现，43个有效成分通过89个靶点对冠心病起到直接调控作用，其中25个成分单独或共同作用于PTGS2、PTGS1、PRKACA、NR3C2、ESR1、CASP3、BCL2、ADRB2、PDE3A、CN5A、PPARG等靶点。图2中度值排名靠前的活性成分依次为槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-儿茶素、黄芩素，这些认为是桂枝茯苓丸治疗冠心病的核心成分。由此可见，中药治疗疾病具有多成分、多靶点的特点。

表1 桂枝茯苓丸43个有效成分收集结果

图1 桂枝茯苓丸-冠心病韦恩图

注：黄色圆形表示药物；蓝色六边形表示成分；绿色菱形表示潜在靶点；边表示它们之间的相互作用图2 桂枝茯苓丸治疗冠心病的“药物-成分-靶点”网络

2.4 PPI网络分析、核心靶点筛选以潜在靶点为基础利用Cytoscape中Bisogenet插件构建PPI网络；采用CytoNCA插件进行拓扑分析和核心网络构建，一级子网络筛选条件：Degree≥29，二级子网络(核心网络)筛选条件：Degree≥221、局部平均连通度(local average connectivity,LAC)≥26.469、Betweenness≥12 319.327、Closeness Centrality≥0.463，共获得70个核心靶点基因，见图3。依照Degree值由大到小排序，展示排名前10位的靶点，见表2。

图3 桂枝茯苓丸治疗冠心病的PPI 网络核心靶点筛选示意图

表2 排名前10位的核心靶点

2.5 GO功能和KEGG富集分析将70个核心靶点基因导入Hiplot在线作图工具，以P<0.05进行GO功能、KEGG通路富集分析。选取GO功能分析中前10条通路绘制气泡图，见图4。结果显示：BP主要涉及细胞代谢、生长、分化、凋亡等；MF主要涉及泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、转录共调节因子激活、钙黏蛋白结合、组蛋白脱乙酰基酶结合、蛋白磷酸酶结合、受损DNA结合、无序域特异性结合、RNA聚合酶II转录因子结合、MHCⅡ蛋白复合物结合；CC主要涉及黏着斑、细胞基质结合、囊腔等。

选取KEGG通路富集分析中前20条通路，见图4，发现核心基因主要富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介导的蛋白水解、Notch、癌症中的microRNA、甲状腺激素、内质网中的蛋白质加工等信号通路。

图4 桂枝茯苓丸治疗冠心病的GO功能和KEGG富集分析气泡图

3 讨论

本研究筛选出桂枝茯苓丸共43个有效成分，210个药物靶基因与889个疾病靶基因相映射，得到包括功能酶、信号分子、转录因子等89个潜在靶点。由此可见，桂枝茯苓丸主要通过调控89个潜在靶点干预机体多种生物进程、多条信号通路来治疗冠心病，并抑制其进展为急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)。对冠心病有调控作用的主要有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-儿茶素、黄芩素等。研究显示，槲皮素通过影响血管细胞增殖、抑制炎症反应途径拮抗动脉粥样硬化[10]，也能减轻心肌缺血再灌注损伤。β-谷甾醇具有调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎等作用[11]。山柰酚具有抗氧化应激活性，可降低血管炎症反应、防止动脉粥样硬化发生、抑制心肌细胞凋亡[12]。儿茶素能抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CRP、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎症介质、下调核转录因子(nuclear factor kappa beta,NF-κB)表达，对冠心病模型大鼠有保护作用[13]。黄芩素对发生缺血、缺氧损伤的心肌具有保护作用[14]。

通过KEGG通路富集分析发现，核心基因主要显著富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介导的蛋白水解、Notch、癌症中的microRNA、甲状腺激素、内质网中的蛋白质加工等信号通路。以PI3K-Akt信号通路最为重要，该通路被激活，关键蛋白Akt将从细胞膜转移到细胞质和细胞核，通过磷酸化抑制或增强靶蛋白活性，进而调节下游信号通路，参与调节细胞代谢、增殖、存活及血管生成等。例如，冠心病患者重要危险因素和治疗目标是血脂中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平[15]。血管内皮下的LDL能被修饰成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路中Akt和eNOS磷酸化，导致血管内皮损伤、血小板聚集、单核细胞浸润、泡沫细胞形成，构成动脉粥样硬化斑块的脂质核心、促进动脉粥样硬化斑块形成[16]。而Akt能激活eNOS促进一氧化氮生成，产生抗炎、抗动脉粥样硬化、抗纤维化、抑制血小板活性、扩张冠状动脉等生物学效应[17]；Akt能激活mTOR抑制细胞自噬进程，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，诱导巨噬细胞自噬，减少巨噬细胞对斑块的浸润，稳定动脉粥样硬化易损斑块[18]，预防ACS发生。Akt还能够磷酸化IKK调节NF-κB信号转导、抑制促凋亡蛋白Bad调控细胞存活、抑制CDK影响细胞增殖。PI3K-Akt信号通路也是FoxO转录因子的主要上游通路，FoxO转录的基因能够调控细胞周期、诱导细胞凋亡、抵抗氧化应激、促进DNA修复等[19]。研究表明，FoxO信号通路参与拮抗心肌纤维化、减轻心脏缺血再灌注损伤[20]。此外，泛素介导的蛋白水解通路能抗氧化、抗炎、降解细胞周期相关蛋白质、抑制血管内膜增生、诱导血管平滑肌细胞凋亡、防止动脉粥样硬化进展[21]。Notch信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡，能通过拮抗心肌纤维化、抑制炎性反应抗动脉粥样硬化，还能抑制平滑肌细胞过度增殖、稳定粥样硬化斑块[22]。癌症中的microRNA通路关联动脉粥样硬化病理过程[23]。甲状腺激素信号通路涉及拮抗心肌重构、调节促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化过程[24]。内质网中的蛋白质加工通路调控内质网应激，干预动脉粥样硬化的发生、发展，调控血管内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞活性、凋亡[25]。因此，桂枝茯苓丸通过介导细胞增殖凋亡、细胞分解、氧化应激、炎症反应等治疗冠心病、防止其进展为ACS。

冠心病是由环境、基因共同作用的复杂疾病，需要采取多种措施进行防治。桂枝茯苓丸能由拮抗动脉粥样硬化、稳定粥样硬化斑块、改善心肌缺血缺氧、抑制心肌纤维化等方面治疗冠心病、防止其进展为ACS，这与冠心病病理生理过程和中医异病同治、治病求本思想相符。综上所述，本研究采用网络药理学的方法论证了桂枝茯苓丸是通过多成分、多靶点、多通路治疗冠心病，为桂枝茯苓丸治疗冠心病进一步研究奠定基础，也为扩展中医经典方剂临床运用提供参考。由于检索数据库有限、分析不全面等主客观因素的存在，使该研究存在一定局限性，仍需进行深入研究。