滋补脾阴方药对脾阴虚证模型大鼠胃肠激素及胃肠免疫功能的影响*

周雯，战丽彬，李媛

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023； 2.辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心，辽宁 沈阳 110847

脾为仓廪之官，后天之本，其主要生理功能是运化水谷精微，化生气血以荣养五脏六腑、四肢百骸。脾阴具有灌溉脏腑、补益脑髓、营养肌肉、濡润筋骨的作用[1-2]。脾阴虚是指脾阴不足，脏腑失其濡养所表现的证候。随着对脾阴虚证研究的不断深入，很多学者认为，其与胃肠激素及胃肠免疫功能的病理改变密切相关[3-5]。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是机体内的一种胃肠道激素，分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)是肠腔中的一类抗体，其含量反映免疫功能。本研究通过观察脾阴虚证大鼠血清VIP、胃sIgA含量及空肠VIP表达情况，探讨滋补脾阴方药对胃肠激素及胃肠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物18只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。饲养于南京中医药大学SPF级动物中心，温度(22±3) ℃，湿度50%，明暗交替12 h。

1.2 药材及试剂滋补脾阴方药(由红参30 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，莲子20 g，白扁豆15 g，远志10 g，石菖蒲10 g，丹参12 g，檀香4.5 g，橘红 9 g，炙甘草9 g组成，来源于大连市美罗医药公司)；伤阴药(由制附子、肉桂、吴茱萸组成，来源于南京中医药大学国医堂)；VIP ELISA试剂盒(上海酶联生物技术有限公司，货号：ml154710)；sIgA ELISA试剂盒(上海酶联生物技术有限公司，货号：ml003136)；VIP免疫组化试剂盒[艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab78536]；2%戊巴比妥钠(北京索莱宝科技有限公司，货号：P8410)。

1.3 仪器酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS公司)；洗板机(芬兰Thermo Labsystems公司)；全自动真空组织脱水机(德国Leica公司)。

1.4 动物分组、建模与给药18只大鼠随机分为正常对照组、模型组、滋补脾阴方药组，每组6只。适应性喂养3 d，自由饮水进食。采用复合因素方法(即饮食不节、劳倦过度与耗伤阴液联合应用)建立脾阴虚证模型[6-7]。脾气虚证模型阶段：大鼠饱食1 d，禁食2 d，1个循环为3 d，在这期间大鼠能够自由饮水，但每日大鼠游泳至力竭，连续 14 d，游泳水温为22 ℃。脾阴虚证模型阶段：第15天，脾气虚证建立成功的模型每日灌胃伤阴药(10 g·kg-1)，正常对照组给予同体积的生理盐水。滋补脾阴方药治疗阶段：第25天至第38天，造模大鼠被分为模型组和滋补脾阴方药组，其中滋补脾阴方药组灌胃滋补脾阴方药，浓度为34.6 g·kg-1·d-1，其余各组给予同体积生理盐水灌胃。

1.5 评估模型参考《中医虚证辨证参考标准》[8]及《中药新药临床研究指导原则》[9]评定脾气虚证模型：①食少；②消瘦；③神疲乏力；④毛色无光泽，便软或溏。脾阴虚证模型标准：①体质量下降；②易激惹；③肛温升高；④粪便呈干燥状态；⑤背毛无光泽；⑥进食量时增时减；⑦饮水量增多。

1.6 标本采集与处理末次给药后，采用2%戊巴比妥钠将大鼠麻醉，腹主动脉取血，留取大鼠的胃、空肠组织。

1.7 检测指标

1.7.1 检测大鼠血清VIP和胃sIgA水平每组6只大鼠，按照试剂盒说明书对样品浓度进行检测：将10 μL样本加入样品孔，后添加稀释液40 μL，将不同浓度标准品50 μL加入标准品孔中；每孔加入100 μL辣根酶标记抗体，37 ℃孵育60 min；洗板5次，吸水纸拍干。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃ 避光孵育15 min，终止液50 μL，450 nm处测定各孔吸光值。

1.7.2 免疫组化法检测空肠VIP表达每组随机选择3只大鼠的空肠标本经40 ng·L-1多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，采用免疫组化法检测大鼠空肠VIP表达水平。步骤如下：①石蜡切片常规脱蜡；②PBS洗2次，每次 5 min；③抗原修复；④用PBS或蒸馏水配置3%H2O2室温封闭 10 min；⑤PBS洗1次，5 min；⑥5%牛奶封闭，室温10 min；⑦加一抗4 ℃过夜；⑧重复步骤②；⑨加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；⑩重复步骤②；辣根酶标记链霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min；重复步骤②；DAB显色3～10 min；染色终止，苏木素复染；脱水，透明，封片，镜检。免疫组化染色的结果判定：细胞浆或细胞膜上出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，阴性细胞核为蓝色。在400倍视野范围用图像分析软件测定棕黄色颗粒的平均光密度值，值越大反映空肠VIP蛋白表达水平越高。

2 结果

2.1 各组大鼠表观指标比较正常对照组大鼠行动迅速，反应敏捷，体格健壮，大便正常，被毛紧密有光泽；模型组大鼠体质量下降，易激惹，肛温升高，粪便呈干燥状态，背毛无光泽，符合脾阴虚证模型评估标准。与正常对照组比较，模型组大鼠体质量显著下降(P<0.05)，肛温显著升高(P<0.01)；与模型组比较，滋补脾阴方药组大鼠肛温显著降低(P<0.05)，体质量无明显变化(P>0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠血清VIP、胃sIgA含量比较与正常对照组比较，模型组大鼠血清VIP含量显著升高(P<0.05)，胃sIgA含量显著降低(P<0.001)；与模型组比较，滋补脾阴方药组大鼠血清VIP含量显著降低(P<0.001)，胃sIgA含量显著升高(P<0.001)，见表2。

表1 各组大鼠体质量及肛温比较

表2 各组大鼠血清VIP、胃sIgA含量比较

2.3 各组大鼠空肠VIP含量比较正常对照组大鼠空肠组织肌间丛与黏膜下可见散在的VIP棕黄色神经元和神经纤维，分布较稀疏，数量较少，色较淡，呈阴性或弱阳性结果；模型组大鼠空肠组织肌间丛与黏膜下则可见VIP阳性神经元，神经纤维明显增多，染色普遍较深，呈阳性或强阳性结果；滋补脾阴方药组大鼠空肠染色较脾阴虚组淡，数量较少，呈弱阳性反应，见图1。

与正常对照组比较，模型组大鼠VIP蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，滋补脾阴方药组空肠组织VIP蛋白表达显著减弱(P<0.01)，见表3。

注：A：正常对照组；B：模型组；C：滋补脾阴方药组图1 各组大鼠空肠VIP阳性表达情况(免疫组化，×400)

表3 各组大鼠空肠组织VIP表达比较

3 讨论

脾五行属土，主运化。《素问·灵兰秘典论》言：“脾胃者，仓廪之官，五味出焉。”《脾胃论》记载：“脾禀气于胃而灌溉四旁，营养气血者也。”脾的生理功能会直接影响机体防御疾病的能力，因而有“脾主为卫，脾虚则百病内生”的说法[10]。研究发现，脾虚、脾气虚、脾阳虚等证型研究较多，而脾阴虚证研究较少。脾阴虚证是脾虚证的重要证型，也是临床常见慢性疾病如消渴、泄泻、便秘等的主要证型[11-13]，脾阴虚证的主要病机是营血津亏、运化失职、濡养无权，其主要症状为食少、腹胀、食后尤甚、大便溏薄、面色无华、倦态乏力、形体消瘦、口干舌燥、手足心热、舌红少津、苔少或无、脉细无力[14]。研究表明，脾阴虚状态下机体免疫功能受损[15-16]。

清代陈修园谓：“脾为太阴，乃三阴之长。故治阴虚者，当以滋脾阴为主，脾阴足，自能灌溉诸脏腑也。”[17]本课题组战丽彬教授从“滋补脾阴”立法论治脾阴虚证，认为其治疗方药应具有补而不燥、滋而不腻、生津化液的特点，因此根据清·吴澄《不居集》中资成汤化裁而成滋补脾阴方药，临床疗效显著。方中以山药为君，善补脾阴；白扁豆益气健脾，与山药配伍可健脾固守中州；红参补脾生津，安神益智，与扁豆共为臣药；莲子合丹参交通心肾，茯苓与莲子均可调补脾阴并安神志，檀香、橘红芳香醒脾，菖蒲合远志化痰开窍，白芍养阴和营，使以甘草，酸甘化阴，益气调药。全方共奏培补后天、滋补脾阴之效，兼能补气理气、活血化瘀、化痰开窍、安神益智。

VIP由神经元、内分泌和免疫细胞产生，广泛存在于中枢神经系统以及免疫系统等，是胃肠道激素的一种，不仅对胃肠运动起抑制性调节作用，并且抑制免疫反应[18-21]。临床及实验研究表明，脾虚证VIP水平均升高[22-25]。本研究结果显示，与模型组大鼠比较，滋补脾阴方药组大鼠血清中VIP含量明显降低，空肠组织VIP蛋白表达减弱。由此推测，VIP功能紊乱可能是脾阴虚证发病的一个重要环节，通过抑制VIP促进胃肠免疫功能可能是滋补脾阴方药发挥作用的途径之一。

sIgA是在人类和大多数其他哺乳动物肠腔中发现的最丰富的一类抗体，被认为是保护肠上皮免受肠道毒素和病原体的第一道防线。sIgA支配肠黏膜的体液免疫[26-27]。由于其聚合性质和多价性，sIgA主要通过非共价交联微生物或大分子保护黏膜表面，从而在空间上阻碍黏附素与上皮细胞的相互作用以及抑制微生物运动，从而促进微生物在黏液中的包埋。sIgA通过蠕动或黏液纤毛运动促进被捕获微生物的清除[28]。研究发现，sIgA是免疫保护的一个关键组成部分，参与维持肠道黏膜的稳定性[29]。因此，sIgA可作为揭示胃肠黏膜免疫功能的一个有效指标。课题组前期研究发现，脾阴虚证模型大鼠肠道sIgA水平降低，滋补脾阴方药能够增加肠道sIgA水平改善肠黏膜免疫屏障的异常状态[30]。本研究结果显示，与模型组大鼠比较，滋补脾阴方药组大鼠胃组织sIgA含量升高。提示脾阴虚时胃组织和肠组织sIgA含量均降低，胃肠免疫功能降低，而滋补脾阴方药则能升高sIgA水平，促进胃肠免疫功能。

综上所述，VIP和sIgA的紊乱很可能是脾阴虚证的病理生理改变之一，滋补脾阴方药可显著降低脾阴虚证大鼠血清、空肠VIP水平及大鼠胃组织sIgA水平，推测滋补脾阴方药治疗脾阴虚证的一条重要途径可能是通过调节胃肠激素和胃肠免疫功能实现的，这为后期科学阐述滋补脾阴方药治疗脾阴虚证的作用机制提供了依据。