高效液相色谱法测定含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊有关物质

邱科先 刘晓芬

感冒作为一种常见的呼吸道疾病，其主要临床表现为头疼、发热、咳嗽、鼻塞、流鼻涕、过敏等。通常用于治疗这些症状的药物包括解热镇痛药（对乙酰氨基酚）、镇咳药（氢溴酸右美沙芬）、抗组胺药（琥珀酸多西拉敏）[1-4]。美国Vicks的感冒药有DayQuil和NyQuil两种，其中NyQuil的主成分是对乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氢溴酸右美沙芬。据此，采用明胶制成一种含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊的复方口服固体制剂，其制备方法如中国专利201310359375.2所述[5]，目前对于该产品的研究仍有待改进。

美国药典43版中，琥珀酸多西拉敏的有关物质测定采用高效液相色谱法（HPLC）[6]；《中华人民共和国药典》2020年二部中，对乙酰氨基酚和氢溴酸右美沙芬的有关物质测定采用HPLC[7-8]，但色谱条件不同。现有技术中还没有能够同时测定含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊有关物质的方法[6-10]。为节约时间和人力，方便生产检验，将上述3种物质的有关物质测定方法进行统一，本研究采用同一种色谱条件测定含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊有关物质，并进行方法验证。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

一种含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊（规格对乙酰氨基酚325 mg；琥珀酸多西拉敏6.25 mg；氢溴酸右美沙芬15 mg）；对乙酰氨基酚内部对照品（批号RS-18099，纯度99.0%）购自安丘市鲁安药业有限责任公司；氢溴酸右美沙芬（批号100201-201204，纯度94.8%）购自中国食品药品检定研究院；琥珀酸多西拉敏（批号R08200，纯度99.9%，USP对照品）购自赫淳生物科技（上海）有限公司；右美沙芬杂质Ⅰ（批号38400，纯度99.7%）、右美沙芬杂质Ⅱ（批号145192，纯度98.7%）、右美沙芬杂质Ⅲ（批号35952，纯度99.7%）、右美沙芬杂质Ⅳ（批号32441，纯度98.1%）购自英国LGC公司。

1.2 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent-Technologies公司）和Thermo Fisher Ultimate3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尓科技有限公司），包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器；电子天平Secura255D、酸度计（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；超声波清洗仪（深圳德瑞超声波设备有限公司）；多功能振荡器（常州国华电器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；药品强光稳定性试验箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）

1.3 方法

1.3.1 溶液的制备 1）稀释液：0.01 mol/L盐酸-甲醇（8∶2）。2）杂质对照品溶液：取右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅱ、右美沙芬杂质Ⅲ、右美沙芬杂质Ⅳ对照品各适量，精密称定，用稀释液溶解并稀释，制成含各已知杂质为40 μg/ml的混合溶液，作为杂质对照储备溶液；取上述杂质对照储备溶液2 ml，用稀释液稀释至20 ml，作为杂质对照品溶液。3）工作对照溶液：取对乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氢溴酸右美沙芬对照品适量，精密称定，用稀释液溶解并稀释，制成含对乙酰氨基酚91 μg/ml、琥珀酸多西拉敏1.75 μg/ml和氢溴酸右美沙芬4.2 μg/ml的溶液，作为工作对照溶液。4）供试品溶液：取含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊，置于250 ml量瓶中，加约120 ml稀释液，加热使囊壳崩解，震摇使混合均匀，用稀释液稀释，制成含对乙酰氨基酚9 100 μg/ml、琥珀酸多西拉敏175 μg/ml和氢溴酸右美沙芬420 μg/ml的溶液，滤过，作为供试品溶液。5）自身对照溶液：取“4）”项下供试品溶液1 ml，置于100 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。6）系统适用性溶液：取“2）”项下杂质对照储备溶液1 ml，置于10 ml量瓶中，用“3）”项下工作对照溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18（250×4.6 mm，5 μm）；流动相A：多库酯钠和乙酸铵的水溶液（取多库酯钠4.45 g和乙酸铵1.54 g，加水2 000 ml，溶解，调节pH至4.5）；流动相B：乙腈-冰醋酸（2∶1），梯度洗脱见表1；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：50 μl。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 系统适用性试验 取系统适用性溶液50 μl，按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

1.3.4 强降解试验 取含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊适量，置于一次性塑料培养皿，分别置于高温（60 ℃烘箱12 d），光照（4 500 Lux和400 μW/cm2，12 d）条件下进行强制破坏，破坏结束后按照供试品溶液的配制方式配制溶液；取含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊适量，置于100 ml量瓶中，分别酸降解（加0.5 mol/L盐酸溶液5 ml，60 ℃水浴中放置2 h）、碱降解（加0.5 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，60 ℃水浴中放置2 h）、氧化降解（加入20 ml稀释液置于50 ℃水浴中加热使囊壳崩解，加30%过氧化氢溶液室温放置2 h），破坏后取出溶液，冷却至室温，碱降解溶液通过加0.5 mol/L盐酸溶液5 ml中和溶液，酸降解溶液通过加0.5 mol/L氢氧化钠溶液5 ml中和溶液，再分别用稀释液稀释至刻度，滤过，取滤液按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

1.3.5 线性研究 取对乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏、氢溴酸右美沙芬和各已知杂质对照品适量，精密称定，加稀释液稀释，制成各成分浓度相对于样品中主成分浓度0.05%、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%水平的溶液，作为线性溶液。取上述溶液按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（y）、进样质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，获得相关系数和计算相对响应因子。

1.3.6 检测限和定量限 取各杂质线性溶液的最低浓度溶液，用稀释液稀释成一系列溶液，按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以能检测的最低浓度作为检测限浓度，以能定量的最低浓度作为定量限浓度。

1.3.7 精密度试验 1）重复性 取含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊，置于250 ml量瓶中，加入相对于样品溶液的0.28%水平的杂质，加约150 ml稀释液，加热使囊壳崩解，震摇使混合均匀，用稀释液稀释，滤过，配制6份，按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用加校正因子的主成分自身对照法计算杂质的含量（未知杂质校正因子按1.0计算），采用不加校正因子的主成分自身对照法计算未知杂质的含量。2）中间精密度 由另一试验员于不同测试日期按重复性项下配制6份溶液，用不同的HPLC系统，不同的对照溶液和不同批号的柱子，按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并按重复性项下计算各杂质的含量。

1.3.8 加样回收率试验 取含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊，置于250 ml量瓶中，分别加入相对于样品溶液的0.05%、0.24%、0.95%和1.43%水平的杂质，加约150 ml稀释液，加热使囊壳崩解，震摇使混合均匀，用稀释液稀释，滤过，每个水平配制3份，按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质的测得浓度，再计算回收率。

1.3.9 稳定性试验 将“1.3.7”项下重复性样品溶液分别放置室温条件和冰箱（2～8 ℃）条件下储存4 d，4 d后按“1.3.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

1.3.10 耐用性试验 1）改变流动相初始比例 按“1.3.7”项下重复性样品溶液的配制方式配制一份样品溶液，按“1.3.2”项下条件以不同流动相初始比例（46∶54、48∶52）进样，记录峰面积，并按“1.3.7”项下计算各杂质的含量。2）改变流动相A的pH“1.3.7”项下重复性样品溶液的配制方式配制一份样品溶液，按“1.3.2”项下条件以不同流动相A pH（4.45、4.55）进样，记录峰面积，并按“1.3.7”项下计算各杂质的含量。

2 结果

2.1 系统适用性试验

结果表明系统适用性溶液中，各已知杂质间的分离度均大于1.5。见图1。

图1 系统适用性溶液的高效液相色谱

2.2 强降解试验

结果表明，在上述破坏条件下，各主成分的纯度角均小于纯度阈值，对乙酰氨基酚与最近的峰的分离度在1.0～1.4，氢溴酸右美沙芬与最近的峰的分离度均为2.4，琥珀酸多西拉敏与最近的峰的分离度在8.2～8.5。各已知杂质、未知杂质与主成分的分离度均大于1.0，均能较好分离。

2.3 线性研究

结果显示各待测成分的相关系数均为1.00，右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅱ、右美沙芬杂质Ⅲ和右美沙芬杂质Ⅳ相对于右美沙芬的相对响应因子分别为1.22、0.79、4.99和1.05。

2.4 检测限和定量限

结果表明主成分和各杂质的检测限在0.000 2%～0.024%范围内，定量限在0.000 4%～0.043%范围内，低于0.05%。

2.5 精密度试验

结果表明，重复性和中间精密度的相对标准偏差（RSD）在0%～8%范围内，均小于10%。

2.6 加样回收率试验

结果表明，右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅱ、右美沙芬杂质Ⅲ和右美沙芬杂质Ⅳ的平均回收率在91%～114%范围内，RSD均小于10%。

2.7 稳定性试验

结果表明，各已知杂质的差值在0.01%～0.08%范围内，对乙酰氨基酚总杂质的差值均为0.01%，均未检出琥珀酸多西拉敏杂质，氢溴酸右美沙芬总杂质的差值在0.1%～0.2%范围内。

2.8 耐用性试验

结果表明，在色谱条件轻微变动情况下，各已知杂质的差值在0.01%～0.02%范围内，对乙酰氨基酚总杂质的差值为0.00%～0.01%，均未检出琥珀酸多西拉敏杂质，氢溴酸右美沙芬总杂质的差值在0.02%～0.03%范围内。

3 讨论

本研究所建方法拟检测的是含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊中对乙酰氨基酚有关物质、氢溴酸右美沙芬有关物质（右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅱ、右美沙芬杂质Ⅲ、右美沙芬杂质Ⅳ和未知杂质）、琥珀酸多西拉敏有关物质。通过验证试验，结果表明该色谱条件下能有效分离各已知杂质和主成分，上述色谱条件对杂质的测定无影响，同时本方法能满足杂质检测灵敏度的要求，精密度和准确度均良好。此外，样品溶液在室温条件和冰箱（2～8 ℃）条件可稳定储存至少4 d，本方法在改变一定流动相初始比例、流动相A的pH变动情况下耐用性良好。

通过原辅料和成品的强降解研究，确认未知杂质是辅料峰或是来源于各主成分的有关物质，进而采用HPLC峰保留时间对比法进行各个主成分的有关物质的定性归属[11]。

对乙酰氨基酚降解会产生杂质——对氨基酚，因带有苯胺结构，具有潜在的基因毒性。本研究色谱采集时间长，而对氨基酚需避光，且稳定性较其他杂质差，因此不采用本研究方法进行对氨基酚的测定。

3.1 测定波长的选择

对乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏、氢溴酸右美沙芬和右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅱ、右美沙芬杂质Ⅲ、右美沙芬杂质Ⅳ对照品，以“1.3.1”项下稀释液作为溶剂进行紫外光谱扫描，氢溴酸右美沙芬、右美沙芬杂质Ⅰ、右美沙芬杂质Ⅳ结果在280 nm的波长处有1个较强的吸收峰，其他杂质和主成分也有较大吸收，因此选用280 nm作为有关物质的测定波长。

3.2 流动相水相的选择

在本研究中，以不同pH的多库酯钠和乙酸铵的水溶液（pH为4.3～4.7）分别作为流动相水相，按照一定比例组成流动相梯度洗脱，从各主成分及其有关物质的分离度、拖尾因子和信噪比综合考虑，选择pH 4.5的多库酯钠和乙酸铵的水溶液作为流动相水相[12]。

3.3 洗脱方式的选择

在本研究中，以“1.3.2”项下色谱条件中流动相A∶流动相B不同比例的流动相进行梯度洗脱，从洗脱时间、各杂质的分离情况、各主成分和各杂质的信噪比、基线平稳情况等方面综合考虑，最终确定了有关物质的梯度洗脱方式[12]。

3.4 进样体积的选择

在本研究中，以25 μl和50 μl分别作为进样体积，从各杂质的分离情况、各主成分和各杂质的信噪比等方面综合考虑，最终确定了50 μl作为进样体积[12]。

3.5 柱温箱温度的选择

在本研究中，以25 ℃、30℃、35℃分别作为柱温，从各杂质的分离情况、主成分的拖尾因子和运行时间等综合考虑，最终确定了30 ℃作为柱温箱的温度[12]。

综上所述，本研究所建方法能同时测定对乙酰氨基酚、琥珀酸多西拉敏和氢溴酸右美沙芬有关物质，简便高效，灵敏度高，准确度、精密度、稳定性和耐用性良好。各已知杂质、未知杂质能与主成分和辅料峰有效分离，可用于含对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬和琥珀酸多西拉敏的软胶囊有关物质的质量控制。