西红花根际可培养细菌菌群结构、多样性及分布规律

张家豪，陆洁淼，丁钰婷，秦路平，朱 波

西红花根际可培养细菌菌群结构、多样性及分布规律

张家豪，陆洁淼，丁钰婷，秦路平*，朱 波*

浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402

探讨西红花根际可培养细菌菌群结构及其分布规律。收集浙江建德、上海崇明、陕西澄城西红花球茎根际土，用传统涂布法分离根际细菌，分析根际细菌菌群结构、多样性及其与球茎生长性状、土壤理化因子间的相关性。共分离得到西红花根际细菌2450株，划分为65个分类单元，归属到4个门，6个纲，17个科，28个属，31种；其中最优势门为厚壁菌门（Firmicutes，相对频率为66.76%），最优势属为芽孢杆菌属（相对频率为57.71%）；产地和土壤理化因子影响西红花根际细菌多样性和菌群结构，陕西澄城2根际细菌多样性指数最高（′＝2.590 1），土壤有效磷含量与多样性指数呈最大正相关（＝0.910，＜0.05）；有机质与苍白杆菌属分离频率呈最大负相关（＝−0.956，＜0.01）；球茎纵径与菌群多样性指数显著相关（＝−0.806，＜0.05）；球茎鲜质量与根际细菌菌群结构显著相关，其中球茎鲜质量与芽孢杆菌属分离频率呈最大正相关（＝0.793，＜0.05）。西红花根际可培养细菌资源丰富，产地土壤理化因子、球茎鲜质量与西红花根际细菌菌群结构和多样性显著相关，高丰度芽孢杆菌属可能对西红花球茎生长起有益作用。

西红花；根际细菌；菌群结构；多样性；土壤理化因子

西红花系鸢尾科番红花属植物西红花L.的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效，可用于经闭癥瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂[1]。现代药理学研究表明西红花具有抗血栓、抗抑郁、抗阿尔茨海默病等作用，临床效果显著[2-4]。

西红花植株是三倍体不育植株[5]，只能通过西红花球茎无性繁殖，一个西红花球茎只能开4～6朵花，每采收110 000～170 000朵花才能收获1 kg干燥的西红花柱头[6]，产量极低，大量依赖进口。西红花球茎地下生长物候期为每年11月至笠年5月，因此根际微生物对西红花球茎生长发育至关重要。已有研究表明，根际细菌可以通过产生生长素、固氮、溶磷等作用[7-9]，促进植物的生长、发育和代谢[10]，韩丽珍等[11]发现根际细菌sp. P5 灌根可以增加花生幼苗鲜质量35.12%。此外，根际细菌多样性和菌群结构的改变可以影响宿主抗病性、抗非生物胁迫能力、生长和品质[12-15]，Hou等[14]研究发现根际施以67种核心菌群可以促进拟南芥在弱光条件下生长但不增强其抗病性，施以116种其他菌群增强了拟南芥的抗病性但不调控其生长，表明根际不同菌群结构的功能具有差异。分析根际微生物多样性和菌群结构与功能的关系对开发微生物资源，保护药用植物资源具有长远意义。

本研究以西红花根际土为研究对象，对西红花根际细菌进行分离、纯化与鉴定，探讨菌群结构与多样性，分析其与产地、球茎大小的相关性，为后续筛选功能菌株菌群提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

西红花球茎采自浙江省建德市、上海市崇明区、陕西省澄城县，各2组，分别编号1、2。经浙江中医药大学张巧艳教授鉴定为鸢尾科番红花L.的球茎。

1.2 试剂与仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×Taq Mix（＋Dye）（莫纳生物科技有限公司）；Regular Agarose G-10（BIOWEST，基因有限公司）；DL2 000 DNA Marker [宝日医生物技术（北京）有限公司]。FA2204B型万分之一电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；YP10002型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；YXQ-LS-75S II型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；LM I-100型霉菌培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；MC-100B型立式恒温摇床（上海牟测仪器科技有限公司）；GenoSens 1850型凝胶成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；1300 Series A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Veriti 96 Well Thermal Cycler型PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5427R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；F-500型火焰光度计（上海元析仪器有限公司）；SpectraMax 190型全波长酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 土壤理化因子测定

按照吴恙等[16]的方法，取西红花球茎根际土。水土比5∶2，以水为浸提剂，采用pH计测定土壤pH；采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量[17]；采用Olsen法测定土壤有效磷[18]；采用标准酸滴定法测定土壤碱解氮[19]；采用火焰光度计测定速效钾[20]。

2.2 球茎生长性状的测定

用直尺测量西红花球茎纵径、横径，用电子天平测量西红花球茎鲜质量。按照球茎鲜质量进行编号如下：浙江建德1（球茎鲜质量＜25 g）、浙江建德2（球茎鲜质量＞30 g）、上海崇明1（球茎鲜质量＜25 g）、上海崇明2（球茎鲜质量＞25 g）、陕西澄城1（球茎鲜质量＜10 g）、陕西澄城2（球茎鲜质量＞15 g），每组50个。

2.3 根际细菌的分离与纯化

用无菌水将根际土配制成0.1～10−6浓度梯度的混悬液，涂布于培养基上分离根际细菌[21]，NA培养基用于分离普通细菌，改良高氏1号培养基用于分离放线菌。

2.4 细菌16S分子鉴定

将分离得到的单一菌株通过单菌落形态特征包括形态、颜色、干湿、凹凸等，进行分类。以天根试剂盒提取细菌DNA。采用16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增。PCR采用50 μL体系，包括25 μL 2×Taq Mix，21 μL ddH2O，2 μL模板DNA，上下游引物各1 μL[22]。扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。测序结果于NCBI进行BLAST比对，采用MEGA 7软件建立系统发育树，确定分离菌株的分类地位。

2.5 根际细菌多样性及组成分析

分离频率以相对频率（relative frequency，RF）表示，具体为分离到的某细菌的菌株数占分离到总菌株数的百分数。优势菌群通过Camargo指数（1/S）确定，如果某一菌群的相对频率＞1/S，则该菌群为优势菌群[23]。采用Shannon-Wiener指数（′）分析根际细菌的生物多样性[24]。采用Pielou均匀度指数（）分析不同物种分布的均匀程度[25]。采用Maragalef指数（）来评价物种丰富度[26]。

2.6 数据分析

采用SPSS软件对西红花生境因子、球茎生长性状与根际细菌RF、多样性进行皮尔逊相关性分析，结果以相关系数（）表示。

3 结果与分析

3.1 西红花根际土壤理化因子

不同产地西红花根际土壤理化因子存在差异（＜0.05）（表1）。供试西红花根际土壤碱解氮变幅为77.011～245.431 mg/kg，其中浙江建德2碱解氮含量最大，达245.431 mg/kg，陕西澄城1球茎最小，质量分数仅为77.011 mg/kg。土壤速效钾平均值为354.299 mg/kg，变幅为76.448～878.290 mg/kg，变幅较大，浙江建德1速效钾含量（878.290 mg/kg）数值最大，上海崇明1速效钾含量（76.448 mg/kg）数值最小，浙江建德1速效钾含量约为上海崇明1含量的11.5倍。土壤pH变幅为5.20～8.33，变幅较小，其中陕西澄城1的pH数值最大，达8.33。

表1 不同产地西红花根际土壤理化因子()

Table 1 Physical and chemical properties of C. sativus rhizospheric soil from different habitats ()

采集地点pH有机质/(g·kg−1)有效磷/(mg·kg−1)碱解氮/(mg·kg−1)速效钾/(mg·kg−1) 浙江建德15.20±0.1319.134±1.09226.072±0.416200.949±5.910 878.290±15.559 浙江建德26.22±0.1521.489±0.62912.215±0.862 245.431±12.552611.921±8.063 上海崇明17.62±0.0622.172±0.08725.625±0.850 156.363±10.018 76.448±5.227 上海崇明28.05±0.1224.100±0.20933.087±1.018113.663±5.992 83.183±7.686 陕西澄城18.33±0.0611.371±0.07851.220±1.296 77.011±7.998 231.828±10.952 陕西澄城28.32±0.0311.251±0.08355.390±1.275127.017±8.351 244.125±10.596

3.2 西红花球茎生长性状

不同产地西红花生长性状存在差异（＜0.05）（表2）。供试西红花球茎鲜质量变幅为8.50～32.05 g，平均鲜质量为21.17 g，其中浙江建德2球茎鲜质量数值最大，达32.05 g，陕西澄城1球茎最小，平均鲜质量仅为8.90 g。球茎横径平均值为3.88 cm，变幅为2.90～4.59 cm，变幅较大，上海崇明2球茎横径（4.59 cm）数值最大，陕西澄城1球茎横径（2.90 cm）数值最小，上海崇明2横径约为陕西澄城1横径的1.6倍。球茎纵径变幅为1.90～3.07 cm，平均值为2.55 cm，其中浙江建德2的纵径数值最大，达3.07 cm。

表2 西红花球茎生长性状()

Table 2 Growth characteristics of C. sativus corm ()

产地横径/cm纵径/cm鲜质量/g 浙江建德13.62±0.31c2.55±0.21c17.39±3.42c 上海崇明14.03±0.16b2.52±0.15c21.82±2.04b 陕西澄城12.90±0.26d1.90±0.20e 8.50±1.93d 浙江建德24.50±0.28a3.07±0.36a32.05±5.75a 上海崇明24.59±0.19a2.93±0.19b31.07±1.44a 陕西澄城23.64±0.23c2.30±0.25d16.20±2.68c

不同字母表示差异显著，＜0.05

Different letters denote significant differences,< 0.05

3.3 根际细菌的纯化与鉴定

共分离得到西红花根际细菌2450株，其中NA培养基共分离得到根际细菌1274株，改良高氏一号培养基共分离得到根际细菌1176株。将上述根际细菌划分为275个形态型。鉴定为65个分类单元，归属于4个门，6个纲，8个目，17个科，28个属，31种（图1）。其中厚壁菌门（Firmicutes）占比最大，RF为66.76%，变形菌门（Proteobacteria）次之，RF达25.27%，65个细菌的16S序列均已提交到GenBank数据库，序列号为MZ026391～MZ026455。

3.4 产地和土壤理化因子与细菌菌群结构和多样性的相关性分析

产地与土壤理化因子影响西红花根际细菌多样性及菌群结构，多样性指数最高的为陕西澄城（′＝2.561 7），上海崇明（′＝2.175 1）次之，最低的为浙江建德（′＝1.987 4），见表3。土壤理化因子与西红花根际细菌多样性显著相关，其中多样性指数与土壤有效磷含量呈最大正相关（＝0.910，＜0.05）（表4）；上海崇明和浙江建德的优势门为厚壁菌门，而陕西澄城优势门为厚壁菌门和变形菌门；上海崇明2的芽孢杆菌属RF值约为陕西澄城2的2.1倍（表3）。土壤理化因子方面，有效磷含量与根际细菌菌群结构最密切，其与芽孢杆菌属RF呈最大负相关（＝−0.914，＜0.05），与微杆菌属RF呈最大正相关（＝0.962，＜0.01）（表4）。

MK-Marker，条带下方为菌株编号

表3 不同产地西红花根际细菌高分离频率属及多样性比较

Table 3 Comparison of high RF and diversity of C. sativus rhizospheric bacteria from different habits

产地分离频率（RF＞5%）H′JR 浙江建德1芽孢杆菌属（65.46%）、类芽孢杆菌属（18.18%）、假单胞菌属（7.27%）1.841 90.718 12.994 5 上海崇明1芽孢杆菌属（66.67%）、赖氨酸芽孢杆菌属（7.02%）、类芽孢杆菌属（7.02%）2.114 30.705 84.699 4 陕西澄城1芽孢杆菌属（45.63%）、苍白杆菌属（32.04%）、微杆菌属（8.74%）2.361 60.788 34.099 5 浙江建德2芽孢杆菌属（75.00%）、赖氨酸芽孢杆菌属（10.71%）、类芽孢杆菌属（5.36%）1.724 30.693 92.732 7 上海崇明2芽孢杆菌属（73.33%）、农杆菌属（8.89%）1.869 60.708 43.415 1 陕西澄城2芽孢杆菌属（35.00%）、苍白杆菌属（28.33%）、微杆菌属（10.00%）、无色杆菌属（8.33%）2.590 10.850 84.904 9

表4 西红花根际细菌多样性、菌群结构与土壤理化因子、球茎大小的相关性分析

Table 4 Correlation analysis of C. sativus rhizospheric bacterial diversity and community with physical and chemical properties and growth characteristics

指标相关系数 pH有机质有效磷碱解氮速效钾鲜质量横径纵径 芽孢杆菌属−0.535 0.951**−0.914* 0.581 0.221 0.793* 0.752* 0.823* 苍白杆菌属 0.619−0.956** 0.900*−0.666 0.280−0.767*−0.773*−0.832* 类芽孢杆菌属−0.880* 0.463−0.582 0.585 0.719 0.125 0.132 0.312 微杆菌属 0.827*−0.794 0.962**−0.822* 0.549−0.578−0.546−0.692 赖氨酸芽孢杆菌属−0.577 0.518−0.861* 0.854* 0.375 0.523 0.475 0.573 无色杆菌属 0.249−0.744 0.625−0.124 0.052−0.380−0.335−0.359 农杆菌属 0.423 0.593−0.087−0.302−0.627 0.611 0.653 0.477 Leclercia属 0.606 0.213 0.190−0.691−0.756−0.030−0.018−0.190 寡养单胞菌属 0.724−0.501 0.641−0.401−0.545−0.094−0.030−0.212 假单胞菌属−0.604−0.201 0.058 0.279 0.711−0.321−0.283−0.122 H′ 0.712−0.843* 0.910*−0.682−0.478−0.724−0.658−0.806* J 0.561−0.917* 0.916*−0.564−0.234−0.677−0.634−0.713 R 0.737−0.503 0.689−0.617−0.690−0.513−0.404−0.627

*表示显著相关，*＜0.05**＜0.01

significant correlations are marked with*,*< 0.05**< 0.01

3.5 球茎大小与细菌菌群结构和多样性的相关性分析

球茎大小与根际细菌菌群结构和多样性显著相关。球茎纵径与多样性指数′呈现显著负相关（＝−0.806，＜0.05）。在相同产地中，浙江建德1的类芽孢杆菌属占比约为浙江建德2的3.4倍（表3）。陕西澄城1的优势属为芽孢杆菌属、苍白杆菌属、微杆菌属，其中苍白杆菌属在西红花根际细菌中的分布与鲜质量呈现显著负相关（＝−0.767，＜0.05）。浙江建德2和上海崇明2的优势属为芽孢杆菌属，共同优势属芽孢杆菌属在浙江建德2的RF约为陕西澄城1的1.6倍，芽孢杆菌属在西红花根际细菌中的分布与西红花球茎鲜质量呈显著正相关（＝0.793，＜0.05）（表4）。

4 讨论

西红花根际可培养细菌资源丰富，共分离出2 450株细菌，归属于4个门，6个纲，8个目，17个科，28个属，31种，其中厚壁菌门分离频率最高，主要以芽孢杆菌属为主，这与姜午春[27]分离根际细菌的结果一致。变形菌门细菌中分离频率最高的属为寡养单胞菌属，该属细菌目前已被报道具有抗病、促生等功能[28]。此外，本研究所得28个属，其中属为一年内刚建立的属[29]，仅作为植物内生细菌被分离[30]。其余属皆已有在土壤中分离的报道，其中芽孢杆菌属、假单胞菌属为常见根际细菌[31-32]，有固氮、溶磷、促生等作用[33-35]。本研究鉴定到种水平的细菌共31种，其中4种为首次从土壤中分离得到，分别是、、、，其中仅作为一种叶际放线菌从土豆的叶际被分离得到[36]。此外，本研究首次从土壤中分离得到细菌，该菌被报道对西红柿具有较好的促生作用[37]。

产地对西红花根际细菌菌群结构和多样性存在影响，多样性指数：陕西澄城＞上海崇明＞浙江建德，陕西澄城多样性指数最高，且苍白杆菌属和微杆菌属RF高于其他产地，为陕西澄城独有优势属。邹立思等[38]采用磷脂脂肪酸技术分析了不同产地太子参根际微生物，报道不同产地的太子参根际微生物含量及群落结构存在较大差异。土壤理化因子与西红花根际细菌菌群结构和多样性显著相关，在本研究中，分析结果显示芽孢杆菌属与有效磷含量存在负相关，可能是芽孢杆菌属细菌具有促进西红花根系吸收磷元素的功能，刘鹏[38]研究发现，解淀粉芽孢杆菌一定程度上增加植物对磷的吸收，增加植株生物量。此外，本研究数据显示速效钾与根际微生物结构没有明显相关性，这与王文铜[39]对花生根际细菌16S rDNA文库进行典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）的结果一致。

植物与根际微生物存在着互利共惠的关系，一方面，植物通过招募有益的微生物，促进自身生长发育、提高对病原菌与非生物胁迫的抗性，另一方面，植物为微生物提供根际共生的栖息场所，并通过释放不同的根系分泌物为微生物提供营养，影响着根际微生物菌群结构与分布[41-42]。本研究表明西红花球茎大小与根际细菌菌群结构密切相关，芽孢杆菌属在西红花根际细菌中的分布与球茎鲜质量呈现正相关，表明高丰度的芽孢杆菌属细菌可能对西红花球茎生长有益。众多研究也表明芽孢杆菌属细菌具有促生功能，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌皆被报道有促生作用，其主要促生机理通过产生植物激素促进植物生长[33, 43-45]。陆续对得到的根际细菌进行了功能筛选，并获得了一批功能菌株，如筛选得到的3株根际细菌SR163、SR253、SR375对拟南芥有较好的促生作用，其他功能筛选正在进行中。本研究为根际细菌菌群优化、土壤修复及药用植物共生微生物资源开发提供了参考依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Community, diversity and distribution of culturable bacteria in rhizosphere of

ZHANG Jia-hao, LU Jie-miao, DING Yu-ting, QIN Lu-ping, ZHU Bo

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China

To explore the rhizospheric bacterial community of Xihonghua () and analyze their correlation with physical and chemical properties ofrhizospheric soil and growth characteristics of.Rhizospheric bacteria were isolated fromrhizospheric soil collected from Zhejiang Jiande, Shanghai Chongming, and Shaanxi Chengcheng by the traditional coating method. Diversity and bacterial community were analyzed and their correlation with habitat factors and growth characteristics were studied.A total of 2 450 strains of rhizospheric bacteria were isolated and divided into 65 taxa belonging to 4 phyla, 6 classes, 17 families, 28 genera, and 31 species. The most dominant phylum was Firmicutes (RF＝66.76%) while the most dominant genus was(RF＝57.71%). Habitat and physical and chemical properties significantly correlation with the diversity and community of the rhizospheric bacteria in. The diversity index of Shaanxi Chengcheng 2 ('＝2.590 1) was the highest. The correlation coefficient of the diversity index with available phosphorus content shows a significant positive correlation (＝0.910,＜0.05). Organic matter is closely related to community structure, whose correlation coefficient withRF ofis the largest (＝−0.956,＜0.01). The longitudinal diameter ofcorm significantly correlation with the diversity index (＝−0.806,＜0.05). Corm fresh weight significantly correlation with the rhizospheric bacterial community. The corm fresh weight had the largest positive correlation with the RF of(＝0.793,＜0.05).There are abundant resources of culturable bacteria in the rhizosphere of. Physical and chemical properties and corm fresh weight significantly correlation with the community and diversity of rhizospheric bacteria in, and the higher abundance ofmay play a beneficial role incorm growth.

L.; rhizospheric bacteria; bacterial community; diversity; soil physicochemical properties

R286.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2499 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.027

2021-10-09

浙江中医药大学人才专项（2021ZR09）；浙江省医药卫生科技青年创新人才支持计划项目（2022RC052）；浙江省优势特色学科（中药学）开放基金资助项目（ZYAOX2018018）

张家豪（1996—），男，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为中药资源及品质评价。

秦路平，教授，博士生导师，研究方向为中药资源及品质评价。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

朱 波，副研究员，硕士生导师，研究方向为植物内生菌。E-mail: zhubo@zcmu.edu.cn

[责任编辑 时圣明]