不同健康状态咖啡根际环境特征比较研究

谭军 孙证 张昂 林兴军 曲鹏 龙宇宙 董云萍

摘  要：咖啡是世界三大飲料之一，具有广泛的营养价值、经济价值和药用价值。咖啡产业已成为我国热带经济作物优势产业之一。咖啡是多年生经济作物，随着其种植年限的增加，老咖啡园更新换代的时候，咖啡产生了严重的再植病，已成为影响咖农增收，制约产业可持续发展的严重问题，亟待解决。为揭示咖啡再植病产生机理，本研究分别在澄迈、琼海和万宁选择代表性咖啡园采集健康和发病咖啡根际土壤，并在毗邻区域采集对照土壤（CK），测定其主要理化指标、酶活性、可培养微生物数量及代谢特征。研究表明：3个地区的健康和发病植株根际土壤pH均极显著低于CK（<0.01），万宁地区发病植株根际土壤全钾、速效钾和全氮含量均不同程度的低于健康植株，但差异均未达显著水平，澄迈地区发病植株根际土壤全氮含量显著低于健康植株（<0.05），3个地区的发病植株根际土壤碱解氮含量均显著高于健康植株（<0.05），琼海地区发病植株根际土壤有效磷和有机质含量均显著高于健康植株（<0.05）;发病植株根际土壤的CAT、POD、纤维素酶、酸性磷酸酶活性高于健康植株，脲酶活性则反之;发病植株根际可培养细菌、真菌和放线菌的数量及其代谢活力均低于健康咖啡植株，微生物多样性降低。相关性分析表明，万宁地区土壤脲酶活性与细菌、放线菌呈显著正相关，澄迈、琼海地区土壤POD与细菌呈显著正相关，3个地区的土壤纤维素酶与真菌均达显著正相关。综上可知，发病咖啡植株根际土壤出现了酸化、养分失衡、微生物多样性降低的问题，咖啡再植病的发生与其根际环境灾变密切相关。本研究结论为克服咖啡再植障碍提供了理论依据。

关键词：咖啡;再植障碍;根际环境;根际微生物中图分类号：S571.2;S-3      文献标识码：A

Comparative Study on Characteristics of Coffee Rhizosphere Environment in Different Health States

TAN Jun， SUN Zheng， ZHANG Ang， LIN Xingjun， QU Peng， LONG Yuzhou， DONG Yunping

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Tropical Crops College， Yunnan Agricultural University， Pu’er， Yunnan 665099， China

Coffee is one of the three major beverages in the world， which has a wide range of nutritional， economic and medicinal value. Coffee industry has become one of the advantageous industries of cash crops in hot areas in China. Coffee is a perennial crop. With the increase of planting years and the renewal of old coffee plantations， coffee has produced serious replantation diseases， which has become a serious problem affecting the income increase of coffee farmers and restricting the sustainable development of industry. So it needs to be solved urgently. In order to reveal the mechanism of coffee replantation diseases， the healthy and diseased coffee rhizosphere soils were collected from the representative coffee plantations in Chengmai， Qionghai and Wanning， respectively， and CK was collected from adjacent areas. The main physical and chemical indexes， enzyme activity， and the quantity and metabolic characteristics of culturable microorganisms were determined. In the three areas， pH of the rhizosphere soil of healthy and diseased plants was significantly lower than that of CK （<0.01）， and the contents of total potassium， available potassium and total nitrogen in the rhizosphere soil of diseased plants were lower than those of healthy plants， and the difference of total nitrogen between healthy and diseased plants was significant in Chengmai （<0.05）; the content of rhizosphere soil of diseased plants alkali hydrolyzable nitrogen in the three regions was significantly higher than that of healthy plants （<0.05）， and the contents of the rhizosphere soil of diseased plants available phosphorus and organic matter in Qionghai were significantly higher than those of healthyplants （<0.05）. The activity of CAT， POD， cellulase and acid phosphatase in the rhizosphere soil of diseased plants was higher than that of healthy plants， while urease activity was on the contrary. The number and metabolic activity of culturable bacteria， fungi and actinomycetes in the rhizosphere of diseased plants were lower than those in healthy coffee plants， and the microbial diversity decreased. Correlation analysis showed that in Wanning， urease activity was significantly positively correlated with culturable bacteria and actinomycetes， in Chengmai and Qionghai POD activity was significantly positively correlated with culturable bacteria， and in the three areas cellulase activity was significantly positively correlated with culturable fungi. In conclusion， the rhizosphere soil of diseased coffee plants appeared acidification， nutrient imbalance and decreased microbial diversity， and the occurrence of coffee replantation diseases was closely related to the rhizosphere environmental disaster. The conclusion of this study would provide a theoretical basis for overcoming coffee replantation diseases.

coffee; replant diseases; rhizosphere environment; rhizosphere microorganism

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.020

咖啡（spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡属（）常绿灌木或小乔木。咖啡是世界三大饮料之一。据统计，2019年我国咖啡种植面积已达9.4万hm。咖啡产业已成为我国热带经济作物优势产业之一。咖啡是多年生经济作物。由于生产年限、气候、土地条件的限制以及品牌效应的存在，再植是绝大多数老咖啡园更新换代的首选。然而再植产生了严重的再植病。至今，咖啡再植病已成为影响咖农增收、制约产业可持续发展的严重问题，亟待解决。

再植障碍广泛存在于各类作物中。研究表明再植梨树苗木成活率低，果实产量低、品质差;再植桃树当年基本不发新根，发枝短且长势弱，多数当年枯死;再植枸杞树存活率低、长势弱。再植障碍成因复杂，其发生与根际土壤理化性质改变、营养元素的亏缺、根际微生物菌群结构失衡等因素密切相关。由于作物对养分的选择性吸收，长期连作导致根际土壤中部分元素发生积累或亏缺，造成养分不均衡，甚至出现盐渍化、酸化，进而导致再植障碍。土壤酶活和根际微生物是根际微生态中最活跃的部分，前者表征土壤物质循环的状态，与土壤肥力高低密切相关，后者影响根际养分的转化、吸收，是植株健康的“晴雨表”。已有的大量研究表明土壤酶活性降低和根际微生物菌群失衡与连作密切相关。由此可知，根际环境灾变是植物再植病发生的重要原因。田间调查发现，老咖啡园更新以及死树原位补种时都存在再植苗成活率低、长势弱等问题。可知迄今为止，有关咖啡再植障碍发生机理的研究还鲜见报道。因此，本研究通过在海南咖啡主产区选择代表性咖啡园采集不同健康状态的咖啡根际土壤研究其理化性质、土壤酶活以及微生物特征，揭示咖啡再植障碍与根际环境灾变之间的内在联系，以期为克服咖啡再植障碍提供理论依据。

 材料与方法

  土样采集

分别在海南3个咖啡主产区选择代表性咖啡园，即澄迈福山咖啡园（19°82′N，109°94′E）、琼海大路镇咖啡园（19°44′N，110°47′E）、万宁兴隆热带植物园咖啡园（18°73′N，110°19′E）采集土壤。各园咖啡种植时间均超过15年，再植咖啡植株普遍出现长势弱、成活率低。在各園中挑选再植均为2年的生长健康和出现再植障碍的咖啡植株各5株，分别采集其根际土壤，并采用5点法在咖啡园毗邻区域采集土壤类型相同但从未种植过咖啡的耕作层土壤作为对照土样（CK）。各土样分别混匀后过10 mm筛，均分成2份，一份保存于4℃冰箱用于测定土壤微生物特征，另一份自然风干后用于测定土壤理化性质和土壤酶活性。

方法

1.2.1  土壤理化性质的测定  参照鲍士旦主编的《土壤农化分析》（第三版），采用NaOH熔融，火焰光度法测定全钾;采用NHOAc浸提，火焰光度法测定速效钾;采用NHF-HCl浸提，氯化亚锡比色法测定速效磷;采用干烧法，有机元素分析仪（Euro Vcctor EA3000）测定全氮;采用碱解扩散法测定碱解氮;采用干烧法，总有机碳分析仪（Multi N/C 3100/1德国耶拿公司）测定有机质;采用便携式pH计（梅特勒-托利多）测定pH和可溶性盐浓度（EC）值。

1.2.2  土壤酶活的测定  脲酶、纤维素酶采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒测定;过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶采用北京索莱宝科技有限公司生产的试剂盒测定。

1.2.3  微生物群落特征测定  可培养细菌、真菌、放线菌采用常规平板计数法测定。微生物群落多样性采用Biolog法测定，用每孔的平均颜色变化率AWCD值来表征，计算公式为： 。式中：C为各培养基孔的光密度值;

为对照孔的光密度值;为培养基种类，Eco碳板值为31;若C–≤0的孔，计算时计为0。

数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，运用最小显著差数法（LSD）进行显著性分析，使用Microsoft Excel 2013软件绘图。

结果与分析

不同健康状态咖啡根际土壤理化特征

由图1A可知，方差分析表明澄迈发病植株根际土壤全钾含量显著低于CK（<0.05），与健康植株根际土壤无显著差异（>0.05）。万宁CK全钾含量最高、健康植株根际土壤次之、发病植株根际土壤最低，但方差分析表明三者间含量无显著差异（>0.05）。由图1B可知，万宁、澄迈、琼海速效钾含量均以发病咖啡植株根际土壤最低。方差分析表明澄迈发病和健康植株根际土壤速效钾含量都显著低于CK（<0.05），澄迈和琼海健康植株根际土壤速效钾含量均高于发病植株，但二者差异不显著（>0.05）。

由图2A可知，3个产区全氮含量均以发病植株根际土壤最低。方差分析表明澄迈健康植株根际土壤全氮含量显著高于CK和发病植株根际土壤（<0.05）;万宁和琼海的各土壤样品全氮含量虽有差异，但不显著（>0.05）。由2B可知，3个地区碱解氮含量均以健康植株根际土壤最低。方差分析表明万宁和澄迈发病植株根际土壤碱解氮含量均显著高于健康植株根际土壤（>0.05），琼海则达极显著水平（<0.01）。

由圖3A可知，3个地区有效磷含量均以发病植株根际土壤最高。方差分析表明琼海发病植株根际土壤有效磷含量极显著高于CK和健康植株根际土壤（<0.01）。如3B可知，3个地区有机质含量均以健康植株根际土壤含量最低。方差分析表明琼海健康植株根际土壤有机质含量极显著低于CK和发病植株（<0.01），但万宁和澄迈各土样间的有机质含量差异不显著（>0.05）。

由图4A可知，3个地区土壤pH均以CK最高，且极显著高于健康和发病植株根际土壤（<0.01），琼海健康植株根际土壤pH也显著高于发病植株（<0.05）。由图4B可知，3个地区土壤EC值均以健康植株根际土壤含量最高。方差分析表明琼海健康植株根际土壤EC值极显著高于CK和发病植株根际土壤（<0.01），万宁健康植株根际土壤EC值极显著高于CK（<0.01），显著高于发病植株根际土壤（<0.05）。

根际土壤酶活性差异

由表1可知，3个地区CAT和POD活性均以发病植株根际土壤最高，健康植株根际土壤次之，CK最低。方差分析表明琼海发病植株根际土壤CAT活性极显著高于CK和健康植株（<0.01）。脲酶活性均以健康植株根际土壤最高，发病植株根际土壤次之，但方差分析表明二者差异不显著（>0.05）。纤维素酶和酸性磷酸酶活性都以发病植株根际土壤最高，健康植株根际土壤次之。

根际微生物群落特征

由表2可知，万宁和澄迈CK可培养细菌、真菌和放线菌均显著低于咖啡植株根际土壤（<0.0）;但琼海CK放线菌数量却极显著高于咖啡植株根际土壤（<0.01）。万宁和琼海发病根际土壤中可培养细菌数量均显著低于健康植株（<0.05），但澄迈二者无显著差异（> 0.05）。澄迈和琼海发病根际可培养真菌显著低于健康植株（<0.05），但万宁二者无显著差异（>0.05）。

由图5可知，3个咖啡园土样中可培养微生物代谢活力随着培养时间增加，均出现先上升后下降的变化趋势，并且都以健康植株根际土壤中的微生物代谢活力最强，发病植株次之，CK最低。

  土壤酶活与可培养微生物相关性分析

由表3可知，万宁地区根际土壤脲酶活性与细菌、放线菌呈显著正相关，相关系数分别为0.762、0.795。根际土壤POD与澄迈、琼海地区根际细菌呈显著正相关（<0.05），相关系数均为0.699。根际土壤纤维素酶活性与万宁地区根际真菌呈显著正相关（<0.05），与澄迈和琼海根际真菌呈极显著正相关（<0.01）。

 讨论

根际环境是植物与环境进行物质交换、能量流动最紧密的场所，极易受自身及外界环境的干扰。养分是植物生长发育、产量品质最直接的影响因素。随着连作年限的增加，樊红科研究表明苹果树根区有效磷含量亏缺，氮、磷、钾比例失衡;ZHAO等研究表明咖啡园碱解氮、速效磷、速效钾等均出现显著下降;赵萌等研究表明西瓜根际土壤有机质、氮、磷、钾等养分发生失衡。本研究表明发病咖啡植株根际土壤有效磷、碱解氮和有机质含量高于健康植株，但全氮、全钾和速效钾含量低于健康植株，存在养分失衡。该结论与前人研究的连作导致土壤养分失衡的结论基本一致。植株根据自身需肥规律按特定比例从土壤中吸收养。长时间的连作会导致部分养分亏缺或者富集，若不及时平衡养分，将会导致植株长势衰弱、产质量下降、最终表现出营养不良。此外，本研究表明3个地区咖啡园土壤均出现酸化，与ZHAO等研究表明结论一致。连作导致土壤酸化是普遍现象。大量学者认为化肥的大量施用，以及根系的呼吸和分泌活动是导致土壤酸化的重要原因。

土壤酶是土壤中最活跃的有机组分之一，其活性强弱影响土壤养分的释放，以及土壤物质和代谢的循环，也是土壤肥料高低的重要评价指标。土壤CAT酶是重要的土壤氧化还原酶，催化分解土壤中的氧化氢，清除其对植物的毒害作用，其活性强弱在一定程度上可以反映有机质转化速度。本研究表明3个地区CAT酶活性均以发病植株最高，健康植株次之，CK最低。这说明与健康植株相比，发病咖啡种植根际土壤积累了大量的过氧化氢，而CAT酶活性的升高可以消除其对咖啡植株的毒害胁迫作用。本研究表明发病植株根际土壤纤维素酶活性高于健康植株，并且相关性分析表明纤维素酶与根际可培养真菌数量呈显著正相关。笔者田间调查发现发病咖啡植株根系发育受阻，根系脱落。根系含丰富的木质素、纤维素。真菌为其降解的主要微生物。这是土壤纤维素酶和可培养真菌数量呈显著正相关的原因。土壤磷酸酶活性高低直接影响土壤磷的转化效率和生物有效性。本研究中3个地区酸性磷酸酶活性均以发病植株根际土壤最高，与根际土壤中有效磷含量变化规律一致。脲酶是一种酰胺酶，参与土壤氮素循环，其活性高低在一定程度上可以表征土壤氮素转化效率。本研究中3个地区脲酶活性均以健康植株根際土壤最高，发病植株次之。这表明前者氮素转化效率高于后者。

根际微生物影响植株的生长发育，养分吸收，抗病、抗逆性，其结构和功能直接影响根际土壤质量、养分可用性和根际生态功能的稳定性。本研究表明3个地区健康咖啡植株根际可培养微生物及其代谢活力均高于发病咖啡植株。这表明发病咖啡植株根际土壤微生物数量减少、种类趋于单一、菌群多样性降低。该研究结果与诸多学者研究的连作降低土壤微生物多样性的结论一致。

此外，本研究表明3个地区土壤可培养细菌、真菌和放线菌的变化规律并不完全一致。如万宁和澄迈CK土样可培养放线菌显著低于咖啡根际土壤，琼海却反之，极显著高于咖啡根际土壤;万宁和琼海发病咖啡根际土壤中可培养细菌数量均显著低于健康植株，澄迈却无显著差异。根际微生物群落受耕作制度、土壤结构与理化性质、作物类型等多种因素的影响。3个地区相隔较远，这也可能是导致本研究中3个地区土样中细菌、真菌和放线菌的变化规律并不完全一致的重要原因。

结论

本研究表明万宁、澄迈、琼海3个地区发病咖啡植株根际土壤养分失衡、酸化;CAT、POD、纤维素酶和酸性磷酸酶活性高于健康植株根;根际可培养细菌、真菌和放线菌数量及其代谢活力均低于健康植株，微生物多样性降低。可知，咖啡再植病的发生与其根际环境灾变密切相关。

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