变应性鼻炎患者外周血PBMC中miR-146a和STAT5b的表达及临床意义

王忠勋，杨超，曹永华

陕西中医药大学第二附属医院耳鼻喉科，陕西 西安 712000

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一种常见的过敏性疾病，受过敏原影响，在多种细胞因子的参与下，涉及IgE 介导的介质释放的鼻黏膜炎症反应，病情严重者伴有哮喘[1-2]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一种广泛存在于生命中的正常调控机制，参与癌症、代谢疾病、神经系统疾病、传染病和自身免疫性疾病过程，广泛存在于患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)、血浆和血清中[3]。根据生理状况、疾病类型和病程，miRNA 分子的类型和数量会发生变化。miR-146 可以调节适应性免疫反应和T 细胞活化[4]。JAK-STAT(Janus 激酶-信号转导和转录激活因子)是一种进化保守的信号通路，可以参与过敏性鼻炎、哮喘等炎症和自身免疫性疾病的发生[5]。信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STATs)位于自身免疫和炎症性疾病发病机制中细胞因子下游，也与变应性鼻炎的发病有关。STAT5b 属于信号转导和转录激活因子家族，研究发现其异常激活和过度表达与肿瘤的发生存在关联，但与AR的关系尚不清楚[6]。本研究主要探讨AR 患者PBMC 中微小RNA-146a(miR-146a)及信号转导和转录激活因子5b (STAT5b)的表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2020年12月在陕西中医药大学第二附属医院治疗的87 例变应性鼻炎患者纳入观察组。纳入标准：(1)诊断符合《变应性鼻炎诊断和治疗指南》中的标准[7]；(2)年龄≥18 岁；(3)近1 个月内未使用抗过敏药物或鼻部喷剂等药物。排除标准：(1)伴有鼻息肉、鼻窦炎等其他鼻部疾病；(2)有肝肾功能障碍、恶性肿瘤、免疫系统性疾病等其他严重疾病；(3)合并有结核、HIV 感染。同时选取在我院治疗的鼻中隔偏曲患者80 例作为对照组。纳入标准：(1)无鼻息肉、鼻窦炎及变应性症状；(2)变应原皮试无阳性反应，血清特异性IgE 阴性；(3)年龄≥18 岁。排除标准：(1)近1个月内接受过激素、抗组胺及免疫治疗者；(2)合并有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肝肾功能障碍等其他疾病。两组患者的一般资料比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性，见表1。本研究经我院伦理委员会批准，患者及家属知情并签署同意书。

表1 两组患者的一般资料比较

1.2 观察指标与检测方法 (1)外周血单个核细胞的提取：分别抽取两组患者外周静脉血4 mL进行抗凝。PBMCs 通过密度梯度离心，分离的乳白色PBMCs层加入1 mL PBS稀释得到BMCs悬液。(2)采用PT-PCR 检测PBMC 中miR-146a 表达：①BMCs 总RNA的提取:将两组患者的PBMCs悬液使用Trizol法提取总RNA后加入35 μL RNase-free水在60℃水浴下5～10 min，使用核酸紫外分析仪检测RNA 浓度，保证OD260/280为1.8～2.0，电泳检测RNA含量。②逆转录合成反应体系：将两组患者的PBMCs 中提取的总RNA 用RNase-free水稀释至2 ng/μL的浓度。RNA模板2 μL，RT引物2 μL，5×RT缓冲液5 μL，dNTP(2.5 mm)2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，20 U/μLRT 酶0.5 μL，ddH2O24 μL。以β-actin 为内参基因，cDNA 为模板进行逆转录。反应系统：cDNA 2 μL，2×SYBR Green qPCR 混合物10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，焦碳酸二乙酯6 μL的二乙氧基碳酸氢盐(DEPC)水，总反应量20 μL，重复3 次，反应条件：95℃10 min；95℃15 min；60℃1 min；40 循 环，72℃30 s。 使 用qRT-PCR 仪扩增操作，使用2-ΔΔCT方法计算miR-146a表达的相对表达。(3)Western blot检测STAT5b表达：将蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物加入到RIPA 缓冲液中，按照蛋白质提取程序提取PBMC 蛋白后，10%SDS-PAGE 电泳分离，电泳转移至PVDF 膜，PVDF 膜封闭后一抗孵育：抗-STAT5b 和抗GAPDH，洗膜，然后二抗孵育2 h，洗膜，显影分析结果。GAPDH 作为内参蛋白。

1.3 鼻部症状评分[8]对流涕、喷嚏、鼻塞、眼痒和咽痒等症状进行评价，每项症状评分为0～3分，其中0分为无症状，1 分为症状较轻，2 分为症状明显，且影响日常活动，3 分为症状严重，影响患者睡眠和日常活动。各项评分之和，≤6 分为轻度，＞6 分为中重度患者。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析。计量资料首先行正态分布检验，符合正态分布则以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例(%)表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson 分析miR-146a、STAT5b 相对表达量与鼻部症状评分的相关性。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者PBMC 中的miR-146a、STAT5b 表达水平比较 观察组患者PBMC 中的miR-146a 和STAT5b相对表达量明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 两组患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表达水平比较(±s)

表2 两组患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表达水平比较(±s)

组别观察组对照组t值 P值例数8780 miR-146a 2.15±0.983.65±1.00-9.7850.001 STAT5b 0.58±0.181.53±0.34-22.8190.001

2.2 不同临床特征AR 患者的miR-146a 表达水平比较 观察组中重度患者PBMC中miR-146a相对表达量明显低于轻度患者，差异有统计学意义(P＜0.05)，而不同性别、年龄、体质量指数和变应原患者PBMC 中的miR-146a 比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 不同临床特征AR患者的miR-146a表达水平比较(±s)

表3 不同临床特征AR患者的miR-146a表达水平比较(±s)

临床资料性别男女年龄(岁)≤30＞30体质量指数(kg/m2)＜24≥24变应原混合真菌其他病情程度轻度中重度例数50375829553253343948 miR-146a相对表达量2.18±0.952.11±0.992.13±0.912.19±0.872.11±0.942.22±0.982.16±0.912.13±0.872.41±0.971.94±0.92 t值0.334-0.294-0.5180.1532.313 P值0.7390.7690.6060.8790.023

2.3 不同临床特征AR 患者的STAT5b 表达水平比较 观察组中重度患者PBMC 中STAT5b 相对表达量明显低于轻度患者，差异有统计学意义(P＜0.05)，而不同性别、年龄、体质量指数和变应原患者PBMC 中STAT5b 比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 不同临床特征AR患者的STAT5b表达水平比较(±s)

表4 不同临床特征AR患者的STAT5b表达水平比较(±s)

临床资料性别男女年龄(岁)≤30＞30体质量指数(kg/m2)＜24≥24变应原混合真菌其他病情程度轻度中重度例数50375829553253343948 STAT5b相对表达量0.60±0.140.55±0.160.56±0.160.62±0.140.56±0.130.61±0.160.59±0.120.56±0.130.79±0.200.41±0.16 t值1.55-1.716-1.5871.1019.848 P值0.1250.0900.1160.2740.001

2.4 miR-146a、STAT5b 相对表达量与鼻部症状评分的相关性 观察组患者PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相对表达量与鼻部症状评分呈负相关(r=-0.544、-0.577，P＜0.05)，miR-146a 和STAT5b 呈正相关(r=0.645，P＜0.05)，见图1。

图1 miR-146a、STAT5b相对表达量与鼻部症状评分的相关性

3 讨论

变应性鼻炎全球发病率较高，患者症状为持续性鼻痒、打喷嚏、流鼻涕等，是哮喘发作的危险因素[9-10]。变应性鼻炎的治疗方法主要是进行过敏原特异性免疫疗法来有效恢复人体免疫力，但该方法的治疗时间较长，可能出现全身性超敏反应[11-12]。随着人们对变应性鼻炎疾病认识的加深，他们发现免疫失衡不足以解释变应性鼻炎炎症反应[13]。研究发现，调节性T 细胞(regulatory T cell，Treg)数量的变化或功能丧失在过敏性疾病的发病机制中起着重要作用[14]。近年来，miRNA 的功能为AR发生机制和治疗方法提供思路，其中miR-146 是Treg 细胞中表达量最高的miRNA 之一，其参与调节免疫系统和丝氨酸-苏氨酸激酶(ROCK1)，增加转化细胞的转移和侵袭[15]。

JAK-STAT 与多种炎症和自身免疫性疾病有关，受到激活时会发生酪氨酸磷酸化和二聚化，形成特殊的信号传递结构，向细胞核传递细胞因子信号，参与免疫调节和免疫细胞的产生[16]。先前的实验表明，STAT5b 也在Treg 细胞中起着重要作用[17-18]。笔者认为miR-146a通过调节STAT5b 来参与AR的发生和发展。STAT5a 和5b 亚型具有高度同源性，但STAT5b的敲除会使Treg 细胞的功能维持受影响，而STAT5a则不会引起对细胞的影响[19]，因此，本研究针对STAT5b进行研究。

本研究结果显示，观察组外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相对表达量明显低于对照组(P＜0.05)。这与已有研究结果[20]一致，笔者猜测miR-146a调节STAT5b 的表达使Treg 分化，患者外周血Treg 细胞减少，影响患者免疫调节功能，导致变应性鼻炎的发生。miR-146a和STAT5b表达水平与变应性鼻炎的疾病活动度有关。本研究中，观察组中重度患者外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相对表达量明显低于 轻 度 患 者(P＜0.05)，进 一 步 验 证miR-146a 和STAT5b 水平与患者病情密切相关。推测miR-146a可能通过调节STAT5b 信号级联发挥负调节功能,参与外周血Treg 细胞的分化和功能维持在变应性鼻炎的发生发展中起重要调节作用。

本研究通过相关性分析证明miR-146a 可以正向调控STAT5b的表达以影响Treg细胞的分化。然而，本研究不能证实miR-146a是否是级联反应中STAT5b的表达和激活所必需的，还需要进一步对机制进行验证。

目前临床中缺少外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 的表达水平与变应性鼻炎病情严重程度之间的关系研究，本研究具有一定的创新性，证实在变应性鼻炎的发病过程中，免疫功能增强和炎性细胞因子激活起重要作用，STAT5b 可以调节外周血Treg 细胞的分化，为变应性鼻炎的临床治疗提供新思路和新靶点，具有一定的研究价值。但本研究缺少相应机制的研究，缺乏实验结果的支持，存在一定的局限性，需要进一步探究。

综上所述，变应性鼻炎患者外周血PBMC 中miR-146a 含量和STAT5b 表达水平下调，与患者病情程度呈负相关，同时两者间存在正相关关系。