巨噬细胞来源外泌体的分离与鉴定

宋枭，薛逸文，郝静，邓润智

南京大学医学院附属口腔医院南京市口腔医院副院长办公室，江苏 南京 210008

慢性牙周炎是口腔颌面部常见的疾病，其最终导致的牙槽骨吸收和牙齿松动、脱落，是成年人失牙的主要原因之一[1]。牙周炎的良好控制可以帮助患者恢复咀嚼功能，促进心理健康，提高生活质量。与其他因肿瘤、外伤或先天性畸形导致的组织缺损再生修复不同，牙周组织再生是在慢性感染性破坏区进行，组织再生修复区即是炎症破坏区。研究显示，牙周组织局部的感染环境影响牙周新附着的形成，最终导致组织再生修复失败[2]。故而在牙周组织工程中，局部的炎症环境调控显得尤为重要。在受到组织损伤及急性炎症刺激后巨噬细胞是最早迁移至组织缺损区的免疫细胞[3]，同时巨噬细胞也是体外成骨细胞分化所必须的，在组织再生修复的不同时期都扮演着至关重要的角色。然而巨噬细胞调控组织再生修复的具体机制仍有待研究。外泌体(exosome)是由细胞分泌、直径在30～140 nm的纳米级囊泡[4]，其功能主要为在细胞间转运相关物质从而实现供受体细胞之间的物质交换和信息交流[5]。在牙周炎的环境中巨噬细胞是否也通过外泌体来实现与成骨细胞间的信息交互，目前仍需要进一步探究。为明确外泌体在巨噬细胞与成骨细胞的串扰间所扮演的角色，本研究通过体外培养巨噬细胞，成功分离并提取了巨噬细胞源性外泌体，并对其表征与标记蛋白进行鉴定，有望为牙周组织再生修复研究提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 细胞 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 购于中国科学院上海细胞库。

1.2 主要仪器和试剂 细胞培养箱(美国Thermo 公司)，高速离心机(美国Thermo 公司)，倒置显微镜(日本Nikon 公司)，超速离心机(美国Thermo 公司)，透射电镜(日本Hitachi 公司)，粒径分析仪(厦门NanoFCM公司)，多功能酶标仪(美国Thermo公司)，凝胶成像系统(上海CLINX 公司)，DMEM 培养基、青霉素-链霉素和胎牛血清FBS (美国Gbico 公司)，PBS缓冲液(美国Hycone 公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海Beyotime 公司)，兔单克隆抗体CD9、CD81、TSG101、Calnexin(英国Abcam公司)。

1.3 细胞培养 在37℃、含有5%CO2的潮湿环境中，使用含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM 培养基将冻存的RAW264.7 细胞系复苏至150 mm 直径大培养皿中，待细胞生长密度达到90%左右时弃掉培养基，PBS缓冲液清洗细胞3次，为排除胎牛血清中外泌体干扰，预先使用超速离心机将血清4℃，11000×g 离心10 h，取上清，以去除血清中外泌体，随后以含有10%去除外泌体的胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培养基培养细胞继续培养。24 h 后收集细胞培养上清液于离心管，4℃、1500×g 离心20 min去除细胞及细胞碎片，将收集到的上清液于-80℃冰箱冻存，用于后续实验。

1.4 外泌体提取 外泌体提取12 h 前将冻存的上清液置于4℃冰箱自然解冻，使用0.22 μm 滤器过滤上清液中含有的胞外囊泡，凋亡小体等粒径大于200 nm的颗粒，然后使用高速离心机4℃、17000×g离心15 min去除上清液中残留细胞器，最后使用超速离心机4℃、110000×g离心80 mim，弃去上清，可见离心管底部微量白色沉淀即为外泌体，取磷酸盐(PBS)缓冲液重悬后于-80℃冰箱冻存用于后续实验。

1.5 BCA 试剂盒测定外泌体的含量 首先使用等量RIPA裂解液将外泌体样本置于冰上裂解10 min，随后按照BCA试剂盒说明书进行浓度测定，具体操作如下，首先配制终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准品，根据样品数量，按50∶1 配置适量BCA 工作液，充分混匀。接下来将标准品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL 分别加到96 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，随后加入20 μL体积外泌体样品到96 孔板中，并设置3 个复孔，加样完毕后，各孔加入200 μL BCA 工作液，37℃放置20～30 min，用酶标仪测定562 nm吸光度，绘制标准曲线并计算外泌体的蛋白浓度。

1.6 透射电镜观察外泌体的形态及大小 取10 μL外泌体样本滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，随后滴加10 μL 2%醋酸双氧铀滴于铜网上染色1 min，滤纸吸去浮液，于室温自然干燥后100 kV条件下进行电镜检测成像，拍照记录外泌体的形态大小。

1.7 外泌体样品粒径分析 取外泌体样本10 μL，用DEPC水稀释50 倍备用，先用标准品进行仪器性能测试合格后进行外泌体上样，注意需进行梯度稀释以避免样本堵塞进样针，待样本完成检测即可获得外泌体粒径及浓度信息。

1.8 Western blot 实验 首先配制浓度为10%或15%的SDS PAGE电泳胶，同时取含40 μg外泌体样本和40 μg 经过提纯后的外泌体标准品(对照)于1.5 mL EP 管中，每管加入30 μL 5×loading buffer，95℃煮10 min 使样品中的蛋白变性；将蛋白样品及Maker按顺序加入上样孔内，140V 恒压下电泳分离，采用湿转法将蛋白转移至PVDF 膜上，室温下于5%脱脂牛奶中封闭1.5 h，与下列一级抗体孵育：anti-CD9(1∶300)，anti-CD81(1∶300)，anti-TSG101(1∶300)，anti-Calnexin (1 ∶300)，随后使用合适的二级抗体IgG-HRP 结合对印迹进行染色，加入ECL 显影液显影，凝胶成像仪拍照记录蛋白条带。

2 结果

2.1 外泌体的含量 使用200 μL PBS 缓冲液将325 mL 巨噬细胞培养基中提取的外泌体重悬，根据562 nm 处不同浓度蛋白标准品的吸光度值绘制标准曲线，见图1，通过BCA法计算可得外泌体蛋白浓度约为2.2304 mg/mL，所收集RAW264.7 细胞外泌体共计约446 μg。

2.2 外泌体的形态及大小 在透射电镜观察下，以超速离心和超滤法获取的RAW264.7细胞来源的外泌体呈现为内部含有不均匀的低电子密度物质的囊泡状结构，平均粒径约为81.20 nm，呈单个散在分布或聚集分布，见图2。

图2 外泌体形态图

2.3 外泌体的粒径及浓度 外泌体的粒径及浓度示意图见图3，显示大多数的外泌体粒径集中在70～100 nm，其平均粒径为81.20 nm，浓度为(2.90E+10)Particles/mL。

图3 外泌体的粒径及浓度示意图

2.4 Western blot实验 Western blot结果见图4，与阳性对照组相比，阳性标记蛋白CD9 及TSG101 均在所提取的外泌体中表达，且表达丰度较高，阴性标记蛋白Calnexin 则无表达，进一步说明了该提取方法成功从巨噬细胞上清液中提取出了外泌体。

图4 Western Blot结果

3 讨论

近年来对于牙周组织再生的研究主要围绕干细胞移植和生物材料两个领域。然而这两种治疗方法都有一定的缺点，干细胞移植存在致畸、栓塞、伦理等问题[6]，生物材料的毒性和免疫原性也可能导致严重的并发症。越来越多的研究表明外泌体具有组织修复潜力，外泌体可以有效地刺激组织和器官，包括心脏[7]、肺[8]、肾[9]等的再生，也可以在体外和体内促进骨再生，同时可以避免直接干细胞移植带来的风险[10]。而其中关于巨噬细胞源外泌体的研究现已广泛应用于肿瘤、炎症及骨再生等领域，在肿瘤微环境中，巨噬细胞通过外泌体与胰腺导管腺癌细胞和上皮性卵巢癌细胞沟通从而诱导其产生化疗耐药性[11]，在头颈部鳞状细胞癌中外泌体也同样参与巨噬细胞和癌细胞间的通讯，为头颈癌治疗干预提供了潜在靶点[12]。同时，M2型巨噬细胞外泌体可以促进小鼠缺血后肢血管生成及骨髓间充质干细胞的成骨向分化[13-14]，且在心脏损伤期间，炎性巨噬细胞衍生的含有miR-155 的外泌体抑制了成纤维细胞增殖并促进成纤维细胞的炎症反应[15]。而目前在牙周组织再生领域中，巨噬细胞外泌体是否也扮演着重要的角色目前尚未可知。因此通过对巨噬细胞外泌体的提取与研究有望为临床上实现牙周组织再生提供了一种新的潜在治疗方法。

由于外泌体是直径在30～140 nm 的纳米级囊泡，其高效的提取方式一直是外泌体研究中一个亟待解决的难题[16]，目前在各种已有的研究中使用较广泛的三种外泌体提取方法分别是密度梯度超速离心法、超速离心和超滤结合法、外泌体试剂盒提取法。其中超速离心和超滤结合法经研究者证实在提取外泌体的性价比方面最高[17]。外泌体蛋白组成主要分为两类，一类是公共部分，在囊泡的形成和分泌过程中普遍存在的蛋白，包括跨膜转运和融合相关蛋白(如Rab、GTPases)、热休克蛋白(如HSP70、HSP90)、四肽跨膜蛋白(如CD63、CD81、CD9)及ESCRT 复合物相关蛋白(如TSG101、Alix)等，其中CD63、CD81、CD9、TSG101在外泌体中高度富集，已成为外泌体的常用标记蛋白[18]。本研究中使用该方法提取的外泌体平均粒径为81.20 nm，Western blot结果中阳性指标CD9及TSG101均在所提取的外泌体中表达，阴性指标Calnexin 无表达等基本特征符合文献要求，成功提取出了巨噬细胞外泌体。目前最常用的外泌体保存技术仍然是低温保存技术，即保存于-80℃或-196℃，此种保存形式的外泌体生物活性在提取后20 d 内最佳，但这种保存方式容易发生冻伤，因此在保存时添加适宜浓度的双糖防冻剂是最佳选择，其中海藻糖被列为最有效的双糖防冻剂[19]。

本研究使用超速离心和超滤结合法成功提取了巨噬细胞来源的外泌体，并对其表征及标记蛋白进行了观察与鉴定。验证了该方法用于提取巨噬细胞外泌体的可行性，并对巨噬细胞外泌体的现有研究、提取方案及改善措施进行了讨论。为进一步研究巨噬细胞外泌体在牙周炎中的作用奠定了基础，并为当前外泌体的提取提供了一定的参考。