千金消澼液对肠黏膜上皮屏障紧密连接蛋白的影响

谷佰健，陈碧心，周建华*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省卫生健康信息中心，长春 130061）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种累及结直肠的慢性非特异性免疫性疾病，是炎性症肠病的一种。主要表现为肠黏膜上皮结构破坏形成溃疡，继而出现黏液脓血便等症状，肠上皮紧密连接（tight junction, TJ）破坏与UC的发病密切相关。千金消澼液（QJXP）是一种能促进黏膜愈合，保护肠黏膜的中药灌肠剂，临床效果良好，在前期研究中发现，QJXP能减少三硝基苯磺酸诱导的结肠组织中嗜中性粒细胞和淋巴细胞，浆细胞的含量[1]，但其对肠粘膜保护机制尚不明确。现通过观察QJXP对肠黏膜上皮屏障TJ作用，丰富QJXP治疗UC的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

人结肠腺癌细胞Caco-2由吉林省酵母表达蛋白质药物研发重点实验室提供。

1.2 药物与试剂

千金消澼液组成为白及10 g，白蔹10 g，白芷10 g，当归10 g，防风10 g，白矾5 g，白芷、当归、防风三味提取挥发油，剩余药渣与白及、白蔹加水煎煮提取，当药液温度降至60 ℃时加入白矾，加水定容至50 mL，搅拌混匀。原液相当于生药1.1 g·mL-1，将原液加入0.1%羧甲基纤维素钠促溶，充分超声震荡，多次离心后取上清溶液，0.22 μm滤膜过滤，以2%FBS的DMEM培养基稀释至1 g·mL-1母液；柳氮磺吡啶（salazosulfapyridine，SASP）依据上述方法分别配置成20 mmol·L-1母液，4 ℃密封避光保存备用。

Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂微型片剂（Thermo fisher A32961）、放射免疫沉淀实验(RIPA)裂解液（碧云天P0013B）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（Thermo fisher 23225）、CCK-8试剂盒 （博士德C0038）、Zo1/Occludin/Claudin-1抗体（Abcam BLR092G/EPR20992/EPRR18871）、羊抗兔二抗/羊抗鼠二抗 (博士德 BST15H06/A15I54）。

1.3 细胞培养

Caco-2自-80℃液氮中取出后迅速置入37℃恒温水浴箱中解冻，解冻后在无菌条件下将细胞移入含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基中，转移至37℃5%CO2孵箱中，隔日更换为含有10%FBS的DMEM培养基，根据细胞生长情况每24 h～36 h换液1次，当细胞生长至70%～80%时使用0.25%胰酶消化液消化传代。

1.4 CCK-8法细胞活性检测

取对数生长期的Caco-2进行96孔板铺板，每孔约5×103，待细胞贴壁24 h后，培养基更换为2%FBS的DMEM培养基加入药物QJXP致终浓度为200.0 mg·mL-1、100.0 mg·mL-1、50.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1；以及依据文献[2]选取SASP为2.0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1浓度进行检测，每组设3个副孔，空白孔以等体积生理盐水填充。培养24 h后，弃去培养基，加 DMEM100 μL 以及 CCK-8溶液 10 μL，37 ℃孵育1 h，酶标仪OD 450 nm检测吸光度。根据细胞活力计算公式[3]计算细胞活性，选取接近正常细胞活性的药物浓度进行后续实验。

1.5 实验设计

Caco-2细胞接种至25 cm 2flask中，每瓶约5×105个，培养48 h后，分为NC组、LPS组、SASP组、QJXP 5.0 mg·mL-1组、QJXP 2.5 mg·mL-1组、QJXP1.0 mg·mL-1组，Caco-2为人结肠细胞，单层培养时具有近似于结肠上皮的细胞极性和紧密链接[4]，此时将培养基更换为含有2%FBS的DMEM培养基，并分别加入3个浓度的QJXP或SASP溶液，预保护1 h后[5]，加入LPS 10 μg·mL-1[6]，24 h后终止实验。

1.6 Western-bolt法蛋白含量检测

提取1.5中的细胞总蛋白，经BCA蛋白定量后蛋白浓度调整至2 mg·mL-1，恒温金属浴蛋白变性后进行Western-bolt法检测目的蛋白含量，各抗体稀释比例参照说明书。以Photoshop对条带背景进行处理，利用Image J图像分析软件对目的条带分析各蛋白灰度值，以GAPDH作为内参蛋白计算各蛋白相对含量。

图 1 QJXP可改善各TJ蛋白相对含量

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度药物对Caco-2细胞活力的影响

本实验检测了QJXP、SASP不同浓度对于Caco-2细胞活力的影响，结果见表1。选取最接近正常细胞活力的药物浓度进行后续实验，QJXP浓度为 5.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1，SASP浓度为1 mmol·L-1，SASP浓度的选取也与之前的研究相符合[2]。

表1 各药物对Caco-2细胞活力的影响（±s，n = 3）

表1 各药物对Caco-2细胞活力的影响（±s，n = 3）

组别 药量/mg·mL-1 细胞存活率/%QXJP/mg·L-1 200.0 24.08±1.17 100.0 26.56±5.36 50.0 94.01±7.75 10.0 92.01±1.19 5.0 92.72±7.22 2.5 88.61±6.94 1.0 109.07±3.46 SASP/mmol·L-1 2.0 94.28±5.30 1.0 98.81±3.80 0.5 107.45±4.52 0.1 110.41±6.40

2.2 千金消澼液对于TJ蛋白Zo-1、Ocludin、Claudin-1的影响

QJXP对 TJ蛋 白 Zo-1、Occludin、Claudin1的影响与 NC组比较，LPS组 Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平显著降低（均P＜0.05），证明建模成功。与SASP组比较，QJXP 2.5 mg·mL-1组Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平无显著差异（P＞ 0.05）；QJXP 1.0、5.0 mg·mL-1组 Zo-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平均显著降低（P＜0.05）。见表2。表明QJXP 2.5 mg·mL-1与SASP对Zo-1、Occludin、Claudin-1的影响等效。

表2 TJ蛋白各组间相对含量（±s，n = 3）

表2 TJ蛋白各组间相对含量（±s，n = 3）

注：与NC组比较，# P＜0.05；与SASP组比较，△P＜0.05

组别 Zo-1 Occludin Claudin-1 NC 组 0.67±0.10 0.81±0.12 0.85±0.12 LPS 组 0.49±0.08#0.52±0.08#0.66±0.10#SASP 组 0.96±0.18 1.13±0.21 1.26±0.23 QJXP 5.0 mg·mL-1组 0.57±0.09△ 0.38±0.06△ 0.88±0.14△QJXP 2.5 mg·mL-1组 0.86±0.09 0.91±0.09 1.03±0.10 QJXP 1.0 mg·mL-1组 0.67±0.10△ 0.76±0.11△ 0.83±0.12△

3 讨论

炎症性肠病的发生主要涉及三种因素影响，包括先天免疫和自噬，这与克罗恩病（Crohn’s disease，CD）密切相关；其次是自适应免疫，在UC、CD的疾病发展有密切联系；最后是肠黏膜屏障功能这在UC的早期疾病发展中起重要作用[7]。黏膜屏障分为4种[8]，包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物屏障。黏膜屏障结构完整则是发挥其免疫防御功能的先决条件[9]，一旦黏膜屏障结构破坏，肠后黏膜通透性升高，会诱导黏膜固有层免疫应答的发生，炎症又会加重黏膜屏障的损坏[10]。机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分，而肠上皮紧密连接TJ是机械屏障的基础。紧密连接蛋白包括咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudins）、连接黏附分子（JAMs)以及3种闭合小环蛋白（ZOs）[11]。研究[12]表明在UC患者的肠黏膜中，肠道隐窝内的祖细胞和杯状细胞的细胞群出现离散，胞内线粒体与内质网结构损坏，上述TJ分泌减少等异常。

千金消澼液为周建华教授根据中医“久病入络”“久病多瘀”理论创立的自拟方，方中白及、白蔹收敛止血，敛疮生肌共为君。当归补血活血止痛，白芷活血排脓，生肌止痛，二者共奏活血止痛之功，即可化肠络之瘀阻，又可缓急止痛。白矾性寒味酸涩，酸可止血敛疮，涩可涩肠止泻，以助君药。防风为治风之要药，善治肠风下血，又引诸药入脾经。现代药理分析表明白及、白蔹等的主要成分对UC，尤其是促进黏膜愈合均有良好作用[13-17]。

综上所述，2.5 mg·mL-1的千金消澼液能通过提高Zo-1、Occludin、Claudin-1含量进而保护肠黏膜上皮屏障，从而达到治疗UC的目的。且效果与SASP无显著差异。