添加剂对万寿菊茎叶青贮品质的影响

侯志江，刘彦培，蔡 明，高月娥，张继才，王 玲，刘建勇，黄必志

（1. 云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南 丽江 674199；2. 云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；3. 云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212）

随着经济作物种植面积不断增加，现有耕地生产的饲草已远远不能满足畜牧业的快速发展[1]，经济作物副产物饲用化俨然成为解决我国当前饲草料不足的关键。万寿菊（Tagetes erectaL）广泛种植于世界各地，其产量已占到全球散花产量的1/2 以上[2]。在我国，万寿菊作为乡村振兴的优势产业，种植面积逐年增加。

目前，种植万寿菊主要是利用花来提取叶黄素，而剩下的大量茎叶成为农业废弃物（约30 t/hm2）[3-4]，这些副产物除少部分被还田处理，剩余的均被丢弃或焚烧，不仅造成资源浪费，而且污染环境。研究表明，万寿菊茎叶（除去花和种子）营养丰富，氨基酸和微量元素种类多且含量高，尤其是茎中含有较高的粗蛋白，而单宁含量相对较低[5-6]，作为潜在的饲料资源，极有必要开展万寿菊茎叶的饲用化研究。

青贮作为一种重要方式广泛应用于各种饲草料的加工与贮藏。万寿菊茎叶具有活性物质多、可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）含量低等特点，单独青贮难度较大，而青贮添加剂在促进青贮发酵及提高青贮品质等方面具有重要作用。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）因能降低青贮中的pH 值，增加乳酸产量，抑制有害微生物繁殖等作用，被广泛用作青贮饲料添加剂[7]；葡萄糖（Glucose，GLU）所提供的碳源可为乳酸发酵提供底物，有助于青贮过程中pH 值降低，确保高质量青贮[8]；甲酸（Formic acid，FA）可以抑制发酵过程中蛋白质和可溶性碳水化合物分解，限制青贮过程中酵母和霉菌生长[9]。因此，本研究以万寿菊茎叶为原料，分析不同添加剂在青贮过程中对其营养成分和发酵品质的影响，综合评价添加剂对万寿菊茎叶青贮的调控效果，旨在找出合理的青贮方案，为万寿菊经济作物副产物饲用化提供技术支持和依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

万寿菊茎叶取自云南省腾冲市某农场。添加剂分别为乳酸菌（台湾亚芯生物科技有限公司，总乳酸菌数为1.0×1011cfu/g）、葡萄糖（天津津北精细化工有限公司，分析纯，含量≥90%）、甲酸（无锡亚盛化工有限公司，分析纯，含量≥88%）。

1.2 试验设计

万寿菊茎叶采收标准为采摘完最后一批商业花朵后的茎叶，收割完成后及时进行机械粉碎至1～3 cm，茎叶碎片晾干至含水量70%时与添加剂充分混合。添加剂的量以鲜质量（Fresh weight，FW）为基础。试验共设4个处理:对照组（CK）；乳酸菌组（LAB），按5.0×106cfu/g 添加；葡萄糖组（GLU），按2 g/kg 添加；甲酸组（FA），按6 mL/kg 添加。每个处理21 个重复。所有试验组装入1 L 聚乙烯青贮袋（北京肉类加工公司）中，为了确保厌氧发酵环境，用真空包装机（北京科友佳生物技术有限公司）抽真空密封，并在25 ℃下室内避光保存，在青贮后第3、6、9、12、15、30、45 天取样（3个重复）分析。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 样品采集与处理方法 青贮前，取一定量万寿菊茎叶样品经65 ℃烘干保存，用于常规养分含量测定，青贮阶段的7 个时间点取样，65 ℃烘干保存，用于测定干物质（Dry matter，DM）和可溶性碳水化合物；青贮45 d后取样，65 ℃烘干保存，用于测定粗蛋白（Crude protein，CP）、中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF）、粗灰分（Crude ash，Ash）等含量，另取10 g 青贮料加入90 mL 去离子水，置于4 ℃浸提24 h，留取过滤后的浸提液进行发酵指标测定。

1.3.2 营养成分分析 干物质、粗蛋白、粗脂肪（Ether extract，EE）、粗灰分、可溶性碳水化合物含量分别采用烘干法、凯氏定氮法（GB/T 6432—94）、石油醚提取法（GB/T 6433—2006）、550 ℃高温灼烧法（GB/T 6438—2007）、蒽酮-硫酸法测定；钙（Ca）和磷（P）含量分别采用高锰酸钾间接滴定法（GB/T 6436—2002）和钼黄分光光度法（GB/T 6427—2002）测定；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素和粗纤维含量采用滤袋分析法测定；相对饲用价值（Relative feed value，RFV）计算公式：RFV=[（88.9-0.779×ADF）×（120/NDF）]/1.29。

1.3.3 发酵品质分析 pH 值采用精密pH 计测定。采用苯酚-次氯酸钠比色法分析氨态氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）的含量。乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）以及丁酸（Butyric acid，BA）含量采用安捷伦1260 液相色谱仪测定，色谱条件：SB-AQ C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm×0.2 μm），pH 值2.70，进样量20 μL，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。

1.3.4 感官评定 参照德国农业协会（Deutche lan Dwirtschafts Geseutschaft）的青贮评分法［10］对样品进行嗅觉、结构及色泽的评分，满分以20分记，分别以一级优良（16～20 分）、二级尚好（10～15 分）、三级中等（5～9分）、四级腐败（0～4分）作为评定结果。

1.4 统计分析

采用统计软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan 氏法进行，数据结果用平均数±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮前万寿菊茎叶营养成分

青贮前万寿菊茎叶营养成分测定结果如表1所示。万寿菊茎叶粗蛋白含量较高，达到11.48%，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维分别达到了44.71%和51.91%，可溶性碳水化合物含量仅为0.96%。

表1 万寿菊茎叶营养成分Tab.1 The nutritional components of stems and leaves of marigold

2.2 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮感官品质的影响

从表2 可以看出，单独青贮万寿菊茎叶的评分为7 分，等级为三级中等，3 种添加剂对万寿菊茎叶青贮品质提高较大，均达到了二级尚好。其中，添加乳酸菌效果要优于添加葡萄糖和甲酸，主要表现为添加乳酸菌后在青贮气味上有较大改善，评分结果为14分。

表2 不同添加剂处理对万寿菊茎叶青贮感官品质的影响Tab.2 Effects of different additives on the sensory evaluation of stems and leaves of marigold

2.3 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮不同阶段干物质的影响

不同添加剂对万寿菊茎叶青贮不同阶段干物质的影响如表3所示。对照组和各处理组随着青贮时间延长，干物质含量呈总体下降趋势。青贮第3天，各试验组干物质含量差异不显著（P＞0.05）；青贮第6—30 天，乳酸菌组和葡萄糖组的干物质含量显著低于对照和甲酸组（P＜0.05）；青贮结束的第45天，所有处理组干物质含量均显著低于对照组（P＜0.05）。

表3 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮不同阶段干物质的影响（FM）Tab.3 Effect of different additives on DM in silage process of stems and leaves of marigold（FM）%

2.4 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮不同阶段可溶性碳水化合物的影响

由表4可知，随着万寿菊茎叶青贮时间延长，可溶性碳水化合物含量呈逐渐下降趋势。青贮前6 d，各试验组可溶性碳水化合物含量变化差异不显著（P＞0.05）；从青贮第9天开始，乳酸菌组和葡萄糖组显著低于对照组和甲酸组（P＜0.05）；青贮第45天，各处理组显著低于对照组（P＜0.05）。而整个青贮阶段乳酸菌组和葡萄糖组的可溶性碳水化合物含量变化差异不显著（P＞0.05）。

表4 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮不同阶段可溶性碳水化合物的影响（DM）Tab.4 Effect of different additives on WSC in silage process of stems and leaves of marigold（DM）%

2.5 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮营养成分的影响

由表5可知，青贮45 d后，乳酸菌组和葡萄糖组粗蛋白含量显著高于对照组和甲酸组（P＜0.05），而对照组和甲酸组的粗蛋白含量差异不显著（P＞0.05）。各处理组的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中，乳酸菌组的中性洗涤纤维含量显著低于其他各组（P＜0.05），葡萄糖组的酸性洗涤纤维含量显著低于其他各组（P＜0.05）。对照组和各处理组的粗灰分含量差异均不显著（P＞0.05）。通过青贮，各处理组的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组，据此所得的相对饲用价值均高于对照组，其中葡萄糖组的相对饲用价值最高，为127.16%。

表5 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮45 d 后营养成分的影响（DM）Tab.5 Effect of different additives on nutritional composition in stems and leaves of marigold after 45 d ensiling（DM）

2.6 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮发酵品质的影响

由表6 可知，经过45 d 的青贮，各处理组的pH值均下降到了4.2 以下，其中，甲酸组显著低于其他试验组（P＜0.05）。经青贮发酵后，乳酸菌组的乳酸含量显著高于对照组和其他处理组（P＜0.05）；甲酸组乙酸含量显著低于对照组和其他处理组，对照组、乳酸菌组和葡萄糖组之间差异不显著；丙酸和丁酸在所有试验组中均未检测到。所有处理组的氨态氮/总氮都低于10，氨态氮/总氮由高到低依次为对照组＞甲酸组＞葡萄糖组＞乳酸菌组，且各试验组间差异均显著（P＜0.05）。

表6 不同添加剂对万寿菊茎叶青贮45 d 后发酵品质的影响（DM）Tab.6 Effect of different additives on fermentation quality in stems and leaves of marigold after 45 d ensiling（DM）

3 结论与讨论

3.1 添加剂对万寿菊茎叶青贮感官评定的影响

青贮成功与否主要受青贮材料的水分、可溶性碳水化合物含量及自身乳酸菌数量等条件的影响［11］。本研究对万寿菊茎叶青贮在气味、色泽及质地方面的综合评定结果表明，万寿菊茎叶的单独青贮效果较差，其原因可能是万寿菊茎叶的可溶性碳水化合物含量和附着的乳酸菌含量较低，从而影响到乳酸菌的发酵。添加乳酸菌、葡萄糖及甲酸后万寿菊茎叶发酵的感官品质得到提升。刘艳芳等［8］研究发现，乳酸菌、葡萄糖及甲酸都能不同程度促进发酵，改善青贮品质，但所有处理在气味上总体评分较低，这很大程度上受万寿菊挥发性萜类物质的影响［12-14］。相比之下，乳酸菌发酵后的万寿菊茎叶评分最高，这可能与乳酸菌对萜类物质具有较强的生物降解和生物转化作用有关［15-17］。

3.2 添加剂对万寿菊茎叶青贮营养成分的影响

青贮初期，对照组和各处理组干物质和可溶性碳水化合物变化差异不显著，进入发酵阶段，乳酸菌组和葡萄糖组干物质和可溶性碳水化合物下降显著，发酵末期，乳酸菌组和葡萄糖组干物质和可溶性碳水化合物变化趋于稳定，这与秦丽萍等［18］和王志敬等［19］的结果一致，主要原因是在发酵初期对于干物质和可溶性碳水化合物的需求较大，而在发酵末期，乳酸菌等微生物活动受环境限制变化不大，从而对能量的消耗减弱。对照组和甲酸组由于缺乏所提供的乳酸菌及发酵底物，发酵缓慢，影响到万寿菊茎叶的正常发酵。本研究中,乳酸菌组和葡萄糖组的干物质和可溶性碳水化合物损失较多，但一定范围的损失也是保证青贮成功的必要条件［19］。

通常情况下，随着青贮发酵过程中干物质的损耗，粗蛋白含量会呈增加趋势，但这一过程也会出现蛋白质的水解［20］。本研究中，乳酸菌组和葡萄糖组中的粗蛋白含量显著高于甲酸组和对照组，说明这2 种添加剂对青贮过程中氮素的损失影响不高，而甲酸组和对照组的粗蛋白损失较大可能是由于发酵条件不利，促使了腐败菌的繁殖，进而造成了粗蛋白的损失［21-22］。青贮后，乳酸菌组和葡萄糖组的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量则显著低于其他处理，相对饲用价值升高，这可能是由于乳酸菌和葡萄糖为发酵提供了良好条件，促使万寿菊茎叶中的纤维素和细胞壁分解［23-24］。刘艳芳等［8］的研究结果也表明，乳酸菌和葡萄糖可以显著降低籽粒苋中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。

3.3 添加剂对万寿菊茎叶青贮发酵品质的影响

pH 值高低在很大程度上决定了青贮品质，低pH 值有助于在厌氧储存期间保持稳定的条件。优质青贮的pH 值是在4.2 以下，本研究所有处理组的pH值均在4.2以下，其中以甲酸组的pH值最低。其原因可能是甲酸通过直接酸化来抑制发酵，并降低了青贮饲料的pH值［9］。

本研究中，甲酸组的乳酸含量较低，这可能也是受甲酸抑制乳酸菌活动特性的影响［9］。添加了乳酸菌和葡萄糖的处理组乳酸含量高，这也验证了充足的底物和一定数量的乳酸菌是保证发酵成功的关键［25］。有学者提出，干物质含量在25%～35%的牧草，青贮后乳酸含量为6%～10%为宜［26］。但周俊华等［20］通过黑麦与小黑麦青贮，以及梁小玉等［24］对菊苣与青贮玉米的混合青贮发现，较低的乳酸含量并不影响青贮品质。因此，对于不同青贮材料在有机酸的含量标准上还需进一步分析和研究。

氨态氮/总氮是青贮蛋白水解的指标之一，可以反映青贮中氨基酸和蛋白质的损失程度，比值越高，说明损失越大［27］。本研究中，添加3种添加剂都能降低氨态氮/总氮比值，这与刘艳芳等［8］的研究结果一致，且所有处理组青贮后的氨态氮/总氮均低于10%，其中，乳酸菌组和葡萄糖组相对较低，分别为6.95%和8.52%。说明万寿菊茎叶中的蛋白质分解较少，营养物质得以较好保存，这也与乳酸菌组和葡萄糖组乳酸含量较高有关，较高乳酸的环境不仅可以阻碍其他微生物生长，并可抑制蛋白质的水解，进而降低了氨态氮/总氮比值。

本研究首次通过添加剂对万寿菊茎叶进行青贮，结果表明，乳酸菌、葡萄糖及甲酸添加剂对万寿菊茎叶青贮效果均有改善，其中以乳酸菌和葡萄糖添加效果较好，由于万寿菊茎叶自身的生物学特性，所有处理青贮后的感官品质均不能达到一级优良。今后，改进万寿菊茎叶青贮的研究，在优化添加剂合理用量的同时，需重点考虑与禾本科牧草的混合青贮，以提高可溶性碳水化合物含量及乳酸菌含量。