基于PLS-DA 方法分析变黄方式对烤烟品质的影响

陈飞程，杨懿德，段玉锋，李生栋，杨 洋，鄢 敏，段卫东

（1. 河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2. 四川省烟草公司宜宾市公司，四川 宜宾 644000；3. 云南省烟草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655001；4. 河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016）

变黄期是烤烟大分子物质开始降解转化、致香物形成、品质彰显的重要阶段[1]。该时期烟叶外观发生巨大转变，内在化学成分剧烈反应，进而促进烟叶品质物质转化和提升，以及烟叶特征香气、感官、外观颜色等品质的形成。当前烘烤过程中应用较为广泛的变黄方式有低温低湿变黄、中温中湿变黄、高温高湿变黄和高温保湿变黄等[2-6]。因此，变黄方式的差异会使得烟叶品质等到不同程度的彰显。如翠碧一号以低温中湿变黄有利于降低细胞壁物质含量，烤后烟化学成分协调，感官质量总体得分最高[6]。豫烟7、9、10 号配合中温高湿变黄，其烤后烟化学成分协调，香气质较好、杂气少且刺激性小，经济性状、外观质量评价最高，感官质量较好[7]。高温中湿变黄对于K326 上部叶烤后烟品质有明显提升[8]。然而，当前关于烤烟品质研究多以化学成分协调性和感官质量为主要评价指标，指标设计不够全面，综合探讨变黄方式对烤烟品质成分和评价指标影响的系统研究较少。为此，设定现有生产中应用较为广泛的阶段降低湿球、胁迫失水变黄、中温中湿和高温保湿4种变黄方式，对烤后烟外观颜色和感官质量进行比较，并对其内在的多酚类物质、常规化学成分、游离氨基酸组分和有机酸组分等烟叶生化成分进行差异分析，同时进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以获得不同变黄方式影响烤烟的差异性生化成分。探究变黄方式对烤烟外观颜色、吸味差异和生化成分的影响，综合获得最优的烤烟变黄方式，旨在为优质烟叶的品质调控和标准化烘烤提供理论支持及技术。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于河南农业大学试验基地（34°8′N，113°48′E）进行。试验材料为云烟116 中部叶，含水率为（84±1）%，采摘时间为2020 年8 月12－19 日。所采烟叶安排在当地的3 层2 路烤房中进行试验，烤房规格为2.7 m×8.0 m×3.5 m 的气流下降式的密集烤房群，装烟竿数为360竿。

1.2 试验设计

试验选取素质一致的鲜烟叶进行装炕，按照同竿同质的要求进行编竿装烟操作，选取其中具有代表性的10 竿烟用于烤后烟叶质量指标测定。根据云烟116 的鲜烟素质[9]、生化指标[10]、烘烤特性[11]，变黄阶段设置阶段降低湿球变黄（T1）、胁迫失水变黄（T2）、中温中湿变黄（T3）、高温保湿变黄（CK）等4种行业中应用较为广泛的变黄处理方式。试验过程中均干燥至叶片含水率45%左右，叶片黄片青筋、凋萎勾尖为止。后续的定色和干筋期均根据三段式烘烤工艺[12]进行。试验重复3次。

阶段降低湿球变黄（T1）：参照刘勇等[5]的变黄方式，在变黄中期（干球38～39 ℃）稳温过程每隔4 h将湿球温度降低1 ℃，最终稳定在36 ℃；

胁迫失水变黄（T2）：参照魏硕等[13]的变黄方式，在变黄前期通过升高干、湿球温度至40 ℃来加快烟叶脱水以保证失水的均匀性，期间湿球温度降低1 ℃，促进失水，用时10 h左右；

中温中湿变黄（T3）：参照王威威等[6]的变黄方式，在变黄期各稳温阶段保持干湿差在2 ℃左右；

高温保湿变黄（CK）：参照孟智勇等[7]的变黄方式，在变黄前期（38/37 ℃）、变黄中期（42/40 ℃）以较高的干湿球温度使烟叶快速变黄后失水。

1.3 指标检测方法

1.3.1 多酚类物质含量检测 参照许美玲等[14]的方法测定不同变黄方式下烤后烟样的多酚类化合物绿原酸（CA）、新绿原酸（NA）、隐绿原酸（CRA）、莨菪亭（CHA）和芸香苷（R）含量。

1.3.2 常规化学成分检测 以不同变黄方式获得的烤后烟样为检测对象，参照马一琼等[15]的方法测定总糖（TS）、还原糖（RS）、烟碱（NIC）、总氮（TN）、淀粉（NS）、钾（K）和氯（Cl）的含量。

1.3.3 烤后烟氨基酸成分检测 参考贾保顺等[16]的方法，测定不同变黄方式烤后烟样品中的脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）共11种游离氨基酸的含量。

1.3.4 烤后烟有机酸成分检测 参考金永明等[17]的方法，采用硫酸甲酯化－气相色谱－内标法测定不同变黄方式的烤后烟样中非挥发有机酸。

1.3.5 烤后烟外形颜色属性检测 采用WSC-3 型全自动色差计，参考贺帆等[18]的方法测定不同变黄方式的烤后烟外观颜色指标亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）、饱和度（C*）和色相角（H*）。

1.3.6 感官评价 由河南中烟技术中心5名具有卷烟感官评价资格的评委进行感官评价。感官评吸方法为，将烤后烟样切丝卷制得到的烟支置于（22±1）℃和RH（60±2）%环境中平衡48 h，参照李生栋等[19]的方法对参比处理的卷烟进行评吸打分。感官总分=（香气质+香气量）×2.4+（浓度+干净程度）×1.6+细腻程度+杂气+刺激性。

1.4 数据处理

采用Origin Pro 2020 分析不同变黄方式下的品质成分；应用DPS 7.05 分析不同变黄方式下品质成分含量间的差异显著性；利用SIMCA-P 11 对不同变黄方式下的颜色和感官品质进行主成分分析，采用PLS-DA 方法对不同变黄方式进行判别分析，再根据变量投影重要性（VIP）的贡献权重分析差异性内在化合物。

2 结果与分析

2.1 变黄方式对烤烟外观和感官品质的影响

2.1.1 烤烟外观颜色指标 不同变黄方式下的烤后烟外观颜色方面（图1），CK 处理的烤后烟亮度L*值显著高于T1、T2 和T3 处理（P＜0.05）。红度a*值表现为T1=T2＞T3＞CK，T2 处理的黄度b*值和饱和度C*值最高。CK 处理外形亮度较高，其原因可能是高温高湿作用导致烟叶干物质消耗过多，烟叶身份较薄，增强了叶面的光反射。因此，从烟叶外观亮度L*值、红度a*值和黄度b*值来看，T2 处理烤后烟的颜色最接近国际色卡橘黄色的色度标准（85，10，95），CK 处理的烤后烟外观颜色则较接近于柠檬黄的色度标准（90，0，80）。

2.1.2 烤烟整体感官品质 变黄方式对烤后烟的香气、烟气和口感等感官评价指标均影响显著（表1）。香气方面，T2处理烤后烟香气质最佳，香气量足且杂气较少，透发性得分最高。烟气方面，T1和T2处理浓度和劲头得分均显著高于其他处理，烟气细腻同时成团性好，尤其以T2 处理最佳。口感方面，CK处理烤后烟刺激性较小、得分最高，烟气干燥感较好，烟气较为纯净，但是回甜感略差，而T2处理则与之相反。整体感官品质总分表现为T2＞T1＞T3＞CK，即T2处理最有利于高品质烤后烟的形成。

表1 不同变黄方式烤后烟的感官质量指标得分Tab.1 Score of sensory quality of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2 变黄方式对烤烟生化品质成分的影响

2.2.1 烤烟多酚类物质含量 由图2 可知，变黄方式对烤烟多酚类物质指标中的绿原酸和芸香苷含量有显著影响（P＜0.05），表现为T2＞T1＞T3＞CK，芸香苷含量表现为T2＞T1＞CK＞T3。各处理烤后烟的新绿原酸、隐绿原酸和莨菪亭含量均较小。

图2 不同变黄方式烤后烟的多酚类含量Fig.2 Polyphenol content of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2.2 烤烟常规化学成分含量 不同变黄方式的烤后烟化学成分如图3所示，TS和RS含量由大到小为T3、T1、T2、CK，说明T3 和T1 处理的中温变黄环境有利于烟叶中总糖和还原糖的形成。TN 和NIC的含量以T2 处理最高，T1 和T3 处理次之，CK 处理最低。NS 含量表现为T3＞T2＞CK＞T1，且各处理间差异显著（P＜0.05），说明高温环境有利于烟叶中的淀粉降解。T2处理的K含量显著高于其他处理（P＜0.05），Cl含量表现为CK＞T3＞T1＞T2。

图3 不同变黄方式烤后烟的常规化学成分含量Fig.3 Chemical composition of tobacco after curing with different yellowing methods

2.2.3 烤烟氨基酸含量 由图4 可以看出，各氨基酸组分中以中性氨基酸脯氨酸的含量最高，天冬酰胺和谷氨酰胺次之，芳香族氨基酸和酸性氨基酸中以苯丙氨酸、色氨酸和谷氨酸、天冬氨酸含量相对较多，碱性氨基酸的含量相对较少。此外，变黄方式对氨基酸各组分含量有显著影响（P＜0.05），脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸等氨基酸的含量均以T2处理最高，天冬酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的含量均以CK 处理最高，T1处理次之。脯氨酸、精氨酸、组氨酸和谷氨酸含量表现为T2＞T1＞CK＞T3，且各处理间有显著差异（P＜0.05）。T3 处理的赖氨酸含量显著高于其他处理（P＜0.05），天冬氨酸则以T1处理含量最高（P＜0.05）。由此可知，高温变黄环境促进脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸生成，但是高温高湿环境对脯氨酸和天冬酰胺的生成又有所抑制，并且促进苯丙氨酸的生成。

图4 不同变黄方式烤后烟的中性氨基酸（a）、芳香族氨基酸（b）、碱性氨基酸（c）和酸性氨基酸（d）含量Fig.4 The content of neutral amino acids（a），aromatic amino acids（b），alkaline amino acids（c），and acidic amino acids（d）in tobacco after curing with various yellowing methods

2.2.4 烤烟中性有机酸成分含量 由表2 可知，不同的变黄方式对烤烟中性有机酸成分中草酸、乙酰丙酸、苹果酸、亚油酸和油酸+亚麻酸均有显著影响（P＜0.05）。草酸含量以T2 处理最高，CK 处理最低；丙二酸含量以CK 处理最高，T2 处理次之，T1 处理最低；乙酰丙酸含量表现为T1＞T2＞T3＞CK；苹果酸含量表现为T3＞T2＞T1＞CK；柠檬酸含量以T3 处理最高，CK 处理最低；棕榈酸含量表现为T1＞T2＞CK＞T3；亚油酸含量表现为CK 处理最高，T3 处理最低；油酸和亚麻酸总量表现为T1＞T3＞T2＞CK。由此可知，高温高湿的变黄环境会促进草酸、乙酰乙酸、柠檬酸、棕榈酸、油酸和亚麻酸的降解，而高温环境变黄会促进苹果酸和亚油酸的形成。

表2 不同变黄方式烤后烟的中性有机酸成分含量Tab.2 Content of neutral organic acids in tobacco after curing with different yellowing methodsmg/g

2.3 基于PLS-DA方法分析变黄方式对烤烟生化成分的影响

为进一步分析获取4种变黄方式下的差异性内在化合物，基于烤烟44 种内在化合物以PLS-DA 方法为手段分析4种变黄方式对烤后烟内在化合物的影响。由图5a 可以看出，数据的分类算法效果较好，可使4种变黄方式样本点完全分开，且没有样品出现交叉的情况，说明4 种变黄处理方式下的烤后烟内在生化成分存在一定的差异。通过PLS-DA 模型下的变量投影重要性排序（VIP＞1）获得了12种区分烤烟变黄方式的差异内在化合物（图5b），分别为还原糖、烟碱、总氮、钾、绿原酸、芸香苷、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苹果酸、乙酰丙酸，其中VIP＞1.5 的物质有烟碱、脯氨酸和绿原酸。综上，这些差异性内在化合物含量的不同导致4种变黄方式下烤烟品质的差异。因此，在烤烟烘烤过程中，可通过调控这些贡献权重较大的品质成分以获得较优品质的烤后烟。

图5 不同变黄方式PLS-DA模型二维得分（a）、VIP值（b）Fig.5 2D score（a），VIP value（b）of PLS-DA model of different yellowing methods

3 结论与讨论

胁迫失水变黄处理烤后烟的颜色最接近国际色卡橘黄色的色度标准，且橘黄色的饱和度高，叶面光泽而不显纤薄，颜色分布均匀，色差较小。其原因是变黄期阶段的高温高湿环境促进了烟叶的水分迁移，随后湿球温度逐渐降低，使过氧化物酶及多酚氧化酶失活，以及叶内的叶绿素得以分解，烟叶在湿热空气中过渡时间更短，从而在一定程度抑制了烟叶的褐变。高温保湿变黄处理的烤后烟外观颜色则较接近于柠檬黄的色度标准，说明较高的湿度与长时间干燥的共同作用造成烟叶干物质的减少，叶片透薄，进而出现较低的亮度值和红度值。高温保湿变黄处理的高温保湿操作使得烟叶初始升温过快，细胞破损严重，容易导致烟叶发生褐变[20-21]。且烤烟处于高湿环境中时间较长，加上较长的烘烤时长为酶促棕色化反应产物的形成提供了充足的时间，这也导致该处理烤黑烟比例较高，类似的现象在香菇[22]的干燥中也有报道。胁迫失水变黄处理阶段的高温高湿与后续阶段降低湿球操作共同作用既保证烟叶变黄与失水的协调，又促进叶内挥发性香气物质的充分释放，故而香气质、香气量最佳，评吸感官最好。变黄期的高温环境可有效增加淀粉酶和蛋白酶活性，促进烟叶烘烤过程中淀粉和蛋白质的热解[23]。胁迫失水变黄处理为变黄期提供了较为稳定的温湿度条件，各化学成分转化较为彻底，故烤后烟化学成分较为协调且符合优质烟叶标准。长时间的高湿环境变黄会促进淀粉热裂解[24]，故高温保湿变黄处理在高温高湿环境中变黄其淀粉含量低于其他处理。氨基酸是构成烤烟感官香气特性的重要成分，可通过与羟基化合物（还原糖、多酚等）发生美拉德反应参与烤烟香气的形成[25]。长时间的高温变黄会促进蛋白质类的热裂解反应，导致氨基酸含量较高；且高湿环境抑制了氨基酸的脱氨脱羧反应[26]。因此，与高温保湿变黄处理相比，胁迫失水变黄和阶段降低湿球变黄处理中性氨基酸含量较高，而芳香族氨基酸含量较低。

挥发性有机酸是卷烟主流烟气中一类重要的香味成分[27]。高温变黄环境下，苹果酸脱氢酶活性升高，促进草酰乙酸向苹果酸的转化[28]，且进一步促进叶片温度的上升，导致过氧化物酶类活性的上升，加快挥发性有机酸的降解[29]，故高温保湿变黄处理的有机酸含量低于胁迫失水变黄处理。

持续的高温高湿环境通过湿热空气的传导加速了叶温的升高[30]，增加了多酚类的热降解反应，叶温升速相对较快，导致叶内酶促反应在变黄阶段持续进行，多酚类物质进一步氧化、裂解，绿原酸和芸香苷等主要多酚物质含量相对较低[31-32]。胁迫失水变黄和阶段降低湿球变黄处理均是侧重控制烟叶水分确保变黄，变黄阶段需适时排湿以保证烟叶满足变黄期的排湿要求，此类变黄方式有利于烟叶中酚糖苷的裂解，促进了多酚类物质的形成。2种变黄方式下的多酚类物质含量均显著高于其他处理，尤其是胁迫失水变黄处理。因此，烘烤变黄阶段适时排湿，有利于减少绿原酸和芸香苷的损失。

变黄方式的不同造成了烤后烟叶常规化学成分、酚类物质、致香物质、游离氨基酸和有机酸间的差异，进而影响烟叶的品质。周平等[33]研究发现，变黄阶段对烤烟常规化学成分和致香物质的贡献率较大，分别达56%、52%。马一琼等[15]研究发现，常规化学成分对感官品质的贡献率最大，其中的烟碱对感官因子的贡献率为53.62%，这与本研究中PLS-DA 模型下变量投影重要性排序烟碱为首位的结果一致。本研究中，绿原酸和钾以较高的贡献权重作为不同变黄方式的标志性化合物，与许自成等[34]的研究结果相符，而脯氨酸作为第二贡献权重值成分以区分变黄方式的不同，这与脯氨酸与感官评吸和外观质量直接相关的研究结果[26-28，35]一致。