阴茎癌的免疫微环境及免疫治疗的研究进展

薛婷 晏如 韩辉

阴茎癌是一种较为罕见的恶性肿瘤，主要病理类型为阴茎鳞状细胞癌(penile squamous cell carcinoma, PSCC)。美国约每100 000男性中存在0.5～2.1例患者，在亚洲、非洲和南美洲等地方，其发病率约占男性所有恶性疾病的1%～2%[1-2]。约有1%～2%的阴茎癌患者会发生转移，主要表现为淋巴结固定、腹股沟淋巴结肿大或盆腔淋巴结肿大，继而扩散至全身部位。腹股沟淋巴结转移的患者5年生存率为20%～40%，发生盆腔淋巴结转移的患者5年生存率低至0%，预后较差[3]。Pagliaro等[4]报道局部晚期阴茎癌患者TIP方案(紫杉醇+异环磷酰胺+顺铂)的客观反应率为50%，是各类指南推荐的标准治疗方案。也有研究者对其他的治疗方案进行了探索，如Djajadiningrat等[5]报道TPF方案(多西他赛+顺铂+5-氟尿嘧啶)的2年无进展生存率(progression free survival, PFS)和疾病特异性生存率(disease free survival, DSS)分别为12%和28%。但由于毒性过大，而限制了其在临床的应用。

近年来，免疫检查点抑制剂的运用开辟了肿瘤治疗的新历史。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)与免疫治疗的效果高度相关，相关的生物标志物也可用来预测免疫治疗的疗效。越来越多的证据表明TME中的各种成分(成纤维细胞、细胞外基质、内皮细胞和免疫细胞等)是肿瘤发生、生长、侵袭和转移的重要组成部分，肿瘤的微环境特征对于评估预后情况也有一定的价值[6]。本文从调控肿瘤免疫微环境的角度分析目前新型免疫治疗策略的应用，有望为优化晚期患者的免疫治疗方案提供参考依据。

一、TME

1.肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)：TILs包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞等，高水平的TILs显著提高了乳腺癌患者新辅助化疗的敏感性和疗效，与肿瘤特异性生存率呈正相关[7]。TILs能够反映出肿瘤的免疫应答和调控作用的趋势，参与癌症免疫编辑和免疫逃逸过程的作用而被广泛研究[8]。

2.CD8+T淋巴细胞：CD8+T淋巴细胞在识别抗原后分化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，通过向免疫突触释放颗粒酶、穿孔素等细胞毒分子、分泌干扰素和肿瘤坏死因子等细胞因子，杀死携带目标抗原的细胞，进一步加速对细胞内病原体的先天和适应性免疫反应。CD8+T淋巴细胞作为抗肿瘤免疫应答的主要效应因子，在肿瘤细胞的适应性免疫防御中发挥关键作用[9]。Ottenhof等[10]对荷兰癌症研究所就诊的213例阴茎癌患者进行了回顾性研究。结果表明，基质内CD8+T细胞数量较少的患者，易于发生淋巴结转移；与Harada等[11]在直肠癌中报道的一致。

3.调节性T细胞(T regulatory cell, Treg)：Treg受特定抗原刺激后，可产生多种抑制性细胞因子(IL-10、TGF-β、CTLA-4等)以达到增强Treg细胞的免疫抑制能力，同时这些因子又可以反馈调节诱导Treg细胞的产生。部分Treg细胞表达颗粒酶B和穿孔素以攻击靶细胞。多种机制联合导致活化T细胞失活抑制机体的抗肿瘤免疫功能，促进肿瘤的进展。Treg细胞表达特异性转录因子Foxp3，可作为识别Treg细胞的标志[12]。Vassallo等[13]通过免疫组化阴茎癌石蜡包埋组织的p16蛋白、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68、CD138、颗粒酶B和Foxp3+进行检测。结果显示Foxp3+淋巴细胞水平能够独立预测预后情况。Cocks等[14]随访了53例局部晚期的阴茎癌患者，发现晚期阴茎癌患者中的CD8+T/Foxp3+Treg比值有明显减少的趋势，阴茎癌伴高水平肿瘤浸润的Foxp3+Treg细胞无病生存几率更低；表明Foxp3可能是一个免疫治疗疗效差的生物标记物。

4.肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)：TAMs多为外周血单核巨噬细胞分化而来，是TME中浸润的主要炎症细胞之一。TAMs分为干扰素γ和脂多糖刺激产生的M1型巨噬细胞(CD68)和IL-4和IL-13等诱导产生M2型巨噬细胞(CD163)。M1型TAMs主要起到杀伤细胞、抑制肿瘤细胞发展和促进适应性免疫反应的作用。而M2型TAMs通过在基底膜破裂和沉积、血管生成、白细胞募集和免疫抑制的作用，促进肿瘤的发展[15]。TAMs可以重塑肿瘤免疫抑制环境，分泌的免疫抑制性细胞因子或蛋白酶会诱导程序性细胞死亡-配体1(programmed death receptor-ligand 1, PD-L1)PD-L1在癌细胞中过表达并激活相关的信号通路，加速肿瘤进展。在阴茎癌中，高CD68+TAMs浸润的患者，肿瘤特异性生存情况有明显的改善、总生存期长和局部复发风险降低[16]。另一项阴茎癌的研究表明，阴茎癌发生淋巴结转移与CD163+TAMs的浸润程度相关[10]。TAMs在TME中发挥了重要的作用，但两种TAMs的作用机制不同。因此，区分何种TAMs在TME中发挥了主导作用，是影响患者预后的关键。M1型还是M2型TAMs是免疫治疗的关键之处。

5.免疫分型：Zhang等[17]收集了来自8例肝细胞癌患者的42份样本。通过CD45和Foxp3的表达情况，将实体肿瘤在组织学上分为3种肿瘤免疫表型：①免疫活性亚型：CD45高表达Foxp3低表达，该亚型中免疫细胞较多，存在一定的抗肿瘤免疫能力，预后较好。然而，其浸润性T细胞的抗肿瘤功能相对较低，需要被进一步激活，所以T细胞反应激活剂(如IL-12和CpG 寡核苷酸)和ICIs的联合使用能够使此类患者获益；②免疫抑制亚型：CD45高表达Foxp3高表达，这一类型的TME内存在大量的免疫细胞浸润，但免疫环境可能受到抑制，此时应用免疫检查点抑制剂可以恢复抗肿瘤效应；③免疫缺陷亚型：CD45低表达，肿瘤实质或间质内几乎完全缺乏T细胞。程序性细胞死亡1(programmed death receptor-1, PD-1)/PD-L1抑制剂无法在此表型中发挥作用，如何诱导产生更多肿瘤特异性T细胞是改善该表型抗肿瘤作用的关键步骤[18]。

Troiano等[19]对口腔舌鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the oral tongue, OTSCC)的免疫表型进行了分析。发现免疫沙漠型肿瘤患者的疾病特异性生存期(HR=2.673)、总生存率(HR=2.591)和无病生存期(HR=2.313)均较差。该研究表明免疫沙漠型是OTSCC患者预后不良的一个评估因素。以上结果表明，肿瘤免疫表型可以作为指导选择合适治疗方法的工具，也可以作为评估患者预后的一个指标。但目前在阴茎癌中还缺少对免疫分型的研究。

二、预测免疫治疗效果的生物标志物

1.肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)：TMB是指肿瘤细胞编码区每Mb DNA的非同义体细胞突变的数量。高频率体细胞突变的发生可能导致新抗原的产生，诱导肿瘤表达大量异常蛋白，这些异常蛋白被免疫系统识别为新抗原，从而引起抗肿瘤免疫反应。因而，TMB高提示产生的新抗原多，应用免疫检查点抑制剂释放的T细胞更有可能识别新抗原，从而达到攻击和杀死肿瘤的作用。美国食品和药物管理局已经批准了pembrolizumab用于TMB≥10 Muts/Mb的不可切除或转移性成年和小儿实体瘤患者[20]。

CheckMate-032试验[21]纳入了401名一线治疗失败的晚期肺癌患者，分两组比较接受Nivolumab单药治疗和Nivolumab与Ipilimumab联合治疗效果的差异。对组织进行靶向基因组测序计算TMB，分为高、中、低3组评估治疗情况。结果显示，TMB高的人群有效率是中、低组的3倍；TMB高组患者的总生存期比低组延长了19个月。Chahoud等[22]对2例初始治疗失败的阴茎癌患者采用派姆单抗治疗。分别检测2例患者的TMB情况，病理完全缓解患者的TMB为14 Muts/Mb，另一位部分缓解患者的TMB值为3 Muts/Mb。以上结果表明，TMB可能是预测患者免疫治疗疗效的一个因素。但TMB与免疫治疗应答的关系仍有待进一步探讨。

2.微卫星不稳定性：微卫星序列在复制过程中极易发生复制错误，导致一个或多个碱基的错配、插入、缺失，发生微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)，使得大量突变在细胞内累积，从而导致肿瘤的发生。DNA错配修复是一种重要的DNA错配修复机制，能识别及修复在DNA复制或重组过程中产生的DNA错配，小范围的碱基缺失或插入，对维持基因组稳定性、遗传后代的精确性有着重要的作用。肿瘤组织出现MSI现象是DNA错配修复缺陷的重要标志[23]。

头颈部鳞癌、肛门鳞癌中MSI-H的发生率约为0.78%。但是在宫颈鳞癌MSI-H的发生率约为11%[24]。Stoehr等[24]通过免疫组化等方式检测了105例阴茎癌患者错配修复蛋白表达的情况。结果表明，错配修复蛋白全部表达，没有MSI的证据。以上结果表明，MSI和dMMR在不同癌种间的差距较大，并不是阴茎癌的常规特征，能否作为阴茎癌PD-1/PD-L1疗效预测的生物标志物有待验证。

3.PD-1/PD-L1表达：近年来的研究表明，T淋巴细胞的活化情况与免疫检查点有着密切的关系。T淋巴细胞介导的免疫反应在某种条件下被抑制，肿瘤发生免疫逃逸并迅速生长、转移。免疫检查点包括：①PD-1和PD-L1；②细胞毒素T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)[25]。T细胞的表面的PD-1蛋白与肿瘤细胞的PD-L1/PD-L2蛋白结合后，提供抑制性信号，诱导了T细胞凋亡、抑制T细胞的活化和增殖，使肿瘤细胞逃脱免疫系统的攻击。约在40%～60%的阴茎癌患者中能够检测到PD-L1的表达[26]。Udager等[27]对37例阴茎癌患者进行了免疫组织化学分析研究，结果显示，37例原发肿瘤中23例(62.2%)PD-L1表达呈阳性，原发肿瘤和转移瘤中PD-L1的表达呈正相关。原发肿瘤的PD-L1表达与区域淋巴结转移显著相关(P=0.024)，与癌症特异性生存率降低(P=0.011)亦显著相关。大多数原发性阴茎癌肿瘤表达PD-L1，其高表达与高风险的临床病理特征和较差的临床结局有关。这些数据为进一步研究抗PD-1和抗PD-L1免疫疗法在晚期阴茎鳞癌患者中的作用提供了理论依据。

4.CTLA-4 表达：CTLA-4的作用与PD-1/PD-L1类似，CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞失活，免疫反应受到抑制，可以帮助实体肿瘤逃避宿主的抗肿瘤免疫。Karpathiou等[28]检测了152例头颈鳞状细胞癌患者的CTLA-4水平，结果显示，肿瘤组织高表达CTLA-4的患者无进展生存期(progression free survival, PFS)及总生存期分别为19个月和32个月，而低表达CTLA-4的患者为42个月和48个月。表明肿瘤CTLA-4的表达情况是评估肿瘤患者预后的一个因素。

三、人类乳头状瘤病毒与免疫微环境关系

多项研究显示，阴茎癌的发病和预后可能相关的因素之一为人类乳头状瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染，由于受病毒分子检测方式、种群的影响，文献报道的阴茎癌患者HPV的感染率差异较大。25%～50%的阴茎癌患者存在HPV病毒感染，其中又以携带高危型HPV 16型和18型占绝大多数[29]。

HPV调控阴茎癌的TME也是增强免疫治疗值得关注的领域。在一项对阴茎癌患者组织免疫组化标志物的研究中，HPV阳性患者的CD8+T细胞水平明显高于HPV阴性患者，表示HPV对阴茎癌的TME有显著影响[16]。此外，Lyford等[30]报道，70%的HPV相关头颈部鳞癌在肿瘤细胞和CD68+TAMs上均表现为免疫抑制分子PD-L1阳性表达，提示在这些患者中使用免疫检查点抑制剂可能获益。Lohneis等[31]进行的一项荟萃分析显示，HPV阳性的阴茎癌患者的肿瘤浸润T细胞的平均数量高于HPV阴性的阴茎癌患者，基质T淋巴细胞明显少于HPV阴性患者。同时还发现HPV阳性的阴茎癌患者中有更多的肿瘤浸润Treg，这可能代表了一种免疫逃避机制，并解释了T细胞无法清除肿瘤的原因。

由于阴茎癌患者较少，免疫相关研究目前报道较少。有限的文献数据表明，HPV阳性阴茎癌患者的TME不同于HPV阴性患者，推测免疫抑制剂可能在两个群体中存在治疗疗效的差异。

四、免疫治疗相关的个案报道

Hahn等[32]报道了3例应用pembrolizumab抑制剂治疗转移性阴茎癌，皆为经历一线化疗及手术治疗失败的患者，疾病进展后对患者施行免疫检查点抑制剂治疗。A患者接受了6个周期的pembrolizumab治疗后，肿瘤体积缩小了34%；B患者在两个周期的pembrolizumab治疗后，CT扫描显示，他的左侧腹股沟淋巴结增大50%。C患者在接受3个周期的pembrolizumab治疗后，可测量病灶增加了172%，并出现了多个新部位的疾病。

Baweja等[33]对1例晚期的阴茎癌患者使用Ipilimumab联合Nivolumab。免疫治疗前肿瘤大小约为12.7 cm×13.8 cm×18.3 cm，接受2个疗程免疫治疗后，CT结果显示仅剩1.2 cm的坏死肿块，同时该患者癌症的相关不良症状逐渐消失。表明对于PD-1/PD-L1效果不佳的患者，联合免疫治疗也可能成为新的治疗方向。以上结果表明，PD-1/PD-L1抑制剂在阴茎癌的治疗中具有一定的理论基础及应用前景。精准识别对免疫检查点抑制剂获益的人群或生物标记物是临床研究的热点。

五、目前正在进行中的免疫相关阴茎癌注册临床试验

拉丁美洲肿瘤学合作组织与默沙东联合发起了一项Ⅱ期临床试验(NCT04224740)，主要研究晚期阴茎癌患者中以顺铂为基础的化疗联合pembrolizumab作为一线全身方案的疗效。Dana-Farber癌症研究所与施贵宝制药联合发起了一项Nivolumab+Ipilimumab用于晚期罕见泌尿生殖器肿瘤的研究(NCT03333616)。美国国立癌症研究所与国立卫生研究院临床中心携手开展了M7824(NCT03427411)治疗HPV相关的恶性肿瘤的临床研究(M7824是一种新型的双功能融合蛋白，该蛋白由靶向PD-L1蛋白的IgG1单克隆抗体和TGF-β受体Ⅱ型融合而成)。以上研究目前仍在招募患者中，相信最终研究的结果能够改善阴茎癌治疗现状[34]。

国内也在陆续开展免疫治疗相关的临床试验。北京市朝阳区桓兴肿瘤医院开展了阴茎癌化疗联合免疫治疗(PD-L1/PD-1)疗效及安全性的单臂前瞻性研究。该研究纳入了局部晚期或远处转移阴茎癌无手术适应症的患者，采用白蛋白紫杉醇+顺铂+博来霉素全身化疗方案联合PD-1单抗(替雷利珠单抗注射液)治疗，评估入组患者的客观缓解率、PFS、总生存期及不良反应发生率。

中山大学肿瘤防治中心也正在开展一项针对局部晚期阴茎癌患者新辅助治疗的Ⅱ期临床研究(NCT04475016)，主要方案为TIP化疗联合特瑞普利单抗和尼妥珠单抗，用于T4/N3阴茎癌患者的新辅助治疗的单臂开放标签的研究，目前正处于患者入组阶段。主要研究终点为病理完全缓解率，该临床试验的结果也值得期待。

六、展望

阴茎癌的免疫微环境研究可以深入了解阴茎癌转移和发展的免疫学规律，为免疫治疗策略制定指明方向。对于局部晚期的阴茎癌，指南中仍主要推荐手术及化疗作为阴茎癌的治疗手段。初步的探索和少量病例治疗观察显示，免疫检查点抑制剂在晚期阴茎癌的治疗中具有一定的应用前景。免疫治疗和靶向治疗单独或联合用于转移性阴茎癌的多项注册临床研究正在进行中。通过外显子组测序、转录组测序及病理学检测等多种方式，为不同特征的患者群体制定个性化的精准医疗，是日后研究的主要方向。