一种新型比率型次氯酸荧光探针的合成及应用研究

＊张路飞 姬媛

（江西科技师范大学有机功能分子研究所 江西 330013）

次氯酸以及次氯酸盐（HClO/ClO-）是生物体内一种重要的生物活性氧（ROS），对入侵细菌和其他病原体的免疫防御中发挥着关键作用。在生物体内，HClO主要存在于各个器官、组织以及各个细胞器中。内源性的HClO主要是过氧化氢和氯离子在髓过氧化酶（MPO）催化下合成，具有强氧化性，在抵御病原体和维持细胞内的氧化还原平衡等方面发挥重要作用[1]。外源性的HClO是由水的氯化消毒产生（Cl2+H2O2→HClO）。HClO含量过高可能导致各种组织损伤和多种人类疾病，例如关节炎、肺损伤、阿尔茨海默病、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病甚至癌症[2-3]。在我们的日常生活中，次氯酸和次氯酸盐被广泛应用在漂白剂、洗涤剂和饮用水消毒剂等方面[4]。过量的HClO会产生三卤甲烷（THMs），对人体和动植物造成非常严重的危害。因此，开发一种快速、灵敏的检测方法来监测生命体内的HClO是至关重要的。

目前，检测HClO/ClO-的方法通常有还原滴定法、电化学测试、色谱分析、比色分析、核磁共振和荧光探针技术等。荧光探针技术已成为临床医学和生物医学研究中不可或缺的工具，与传统的方法相比，荧光分析法在生理条件下的应用具有许多优点，例如较高的灵敏度、较好的选择性、操作简单、低成本、快速响应率、实时检测、便捷的可视化等。除了良好的灵敏度和选择性外，长波长发射的荧光探针更适合生物成像，因为它具有生物样品光损伤最小、穿透深度高和背景自发荧光低的优点。此外，比率型荧光探针能更好地消除背景信号的干扰，更利于获取准确的检测信号，可以通过两个相关发射进行自校准，具有更好的灵敏度。荧光探针的发光机理主要有光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）、激发态分子内质子转移（ESIPT）、聚集荧光增强（AIE）等。荧光探针检测法通过探针分子实现特异性识别目标分子，探针与目标分子结合后荧光光谱发生显著变化。

在此，我们设计并合成了一种新型比率型荧光探针LyCl，对HClO的选择性优于其他分析物，1,4-二甲基吡啶碘化物增加了化合物的水溶性。在没有HClO的情况下，探针的荧光是通过分子内电荷转移（ICT）过程从供体到受体呈红色。添加HClO后，ICT过程将中断，导致红色通道发射熄灭，黄色通道发射开启，实现了通过比值法测定HClO，在次氯酸的分析检测方面具有良好的应用前景。

1.实验部分

(1)试剂和仪器

所有的化学试剂都是通过伊诺凯化学试剂公司购买的，无需进一步提纯就可以使用。

表1 实验试剂及规格

续表

分析测试所用到的仪器及型号如下表：

表2 实验仪器及型号

(2)探针的合成和表征

图1 探针LyCl的合成路线

①化合物2的合成。在0℃下将PBr3（7.2mL，76.6mmol）滴加到7.2mL DMF和25mL三氯甲烷的混合溶液中，然后将反应溶液搅拌1h，滴加环己酮（2.6mL，25.5mmol），将混合物在室温下搅拌8h。反应完成后将反应液倒入150mL的冰水中，加入碳酸氢钠调节溶液的pH等于7，用二氯甲烷（50mL×3）萃取，然后用H2O和饱和食盐水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠干燥。干燥完成后在真空中浓缩得到化合物1，无需进一步纯化直接用于下一步。将化合物1（1g，5.3mmol），2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（0.8g，5.3mmol）和Cs2CO3（5.65g）溶解在DMF（20mL）中，在室温下搅拌16h。浓缩，残余物溶于二氯甲烷并用水（30mL×3）萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩。所得的粗产品通过柱层析（石油醚:乙酸乙酯=4:1）进一步提纯，最后得到深黄色的化合物2（1g，78%）。

②化合物Ly-OH的合成。在0℃时，将BBr3（3mL）滴加到含有化合物2（0.6g，2.5mmol）的无水二氯甲烷溶液（20mL）中，反应溶液在室温下搅拌16h。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，随后用二氯甲烷（30mL×3）萃取，然后加入无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，得到的粗产品用硅胶柱色谱法进一步纯化，二氯甲烷:甲醇（20:1-10:1）作为洗脱剂，最后得到黄色固体Ly-OH（0.65g，82%）。

③1,4-二甲基吡啶碘化物的合成。将1mL（10.7mmol）4-甲基吡啶和1mL（16mmol）甲基碘溶解在4mL无水乙醇中，搅拌并在80℃下回流0.5h。反应完成后低温冷却并添加少量的环己烷洗涤固体，干燥得到白色固体（2.38g，94%）。

④探针LyCl的合成。在50ml三口烧瓶中加入化合物Ly-OH（0.1g，0.44mmol）、化合物2（0.11g，0.44mmol）、无水乙醇（4ml）和哌啶（2滴）。将反应搅拌并加热回流12h。反应完成后冷却并去除溶剂，然后通过使用CH2Cl2:CH3OH（20:1）硅胶柱层析纯化，最后得到紫黑色固体LyCl（0.1g，72%）。1H NMR（500MHz，d6-DMSO，ppm）：δ=8.38（d，J=5Hz，2H），8.14（d，J=15Hz,1H），7.81（d，J=5Hz，2H），6.99（d，J=10Hz，1H），6.78（s，1H），6.51（s，1H），6.38（d，J=10Hz，2H），6.35（d，J=15Hz，2H），4.04（s，3H），2.51（m，2H），2.45（m，2H），1.71（m，2H）；13C NMR（500MHz，d6-DMSO，ppm）：δ=168.20，154.92，154.82，152.65，143.23，135.21，128.52，127.69，121.50，120.85，115.49，114.71，110.49，109.10，102.76，45.68，28.69，24.40，20.76。

(3)光谱分析

光谱实验是在PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中进行测试的。通过添加少量的HCl溶液和NaOH溶液使PBS缓冲溶液的pH值在2.0和12.0之间。荧光发射光谱记录范围为475nm至900nm（激发波长为465nm），吸收光谱记录范围为300nm至600nm。比率型荧光探针LyCl母液的制备：称取适量探针LyCl溶于二甲基亚砜中，得到浓度为1.0mmol/L的母液。其他分析物溶液的制备：将适量的分析物溶解在纯水中，制得浓度为10mmol/L的储备液，现配现用。

(4)检测限的计算

检测限=3σ/k

表示11次空白样品的标准偏差，k是指荧光比率I580/I690与HClO浓度线性关系的斜率。

2.结果与讨论

(1)探针对HClO的选择性与干扰性响应研究

对目标分子的高选择性是分子探针的一个主要问题。图2（a）显示出含有探针LyCl的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO以及其他分析物（K+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Na+、GSH、Hcy、Cys、HS-、HCN-）后的荧光光谱变化。可以看出，探针LyCl在580nm处和690nm处有一个发射峰，添加HClO后，690nm处的荧光发射峰逐渐降低，580nm处的发射峰逐渐增强。因此，我们可以通过荧光发射信号的比率（I580/I690）来检测HClO。在相同条件下，分别加入其他分析物后荧光发射光谱变化可忽略不计。同时，还测试了HClO对其他分析物的抗干扰能力（图2b）。结果表明，在其他分析物的存在下，探针依旧能够实现对HClO进行快速识别，且竞争离子对HClO的干扰比较小。以上实验结果表明，探针对HClO具有较好的选择性与较强的抗干扰能力。

图2 （a）向含有LyCl（20μM）的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM）以及其他分析物后的荧光光谱变化以及加入其他分析物后的I580/I690处的荧光强度变化；（b）λex=460nm

(2)荧光光谱性质研究

我们对探针与不同浓度的HClO响应后的荧光性质进行了研究。如图3所示，探针本身在580nm和690nm处有两个发射峰，随着HClO浓度的增加，荧光光谱比率发生变化，690nm处的荧光强度逐渐减弱，580nm处的荧光强度逐渐增强，并逐渐达到最大。此外，还发现荧光发射比率信号I580/I690与HClO浓度之间存在线性关系，检测限为26.5μM。这些结果表明探针对HClO有很高的灵敏度。

图3 （a）向含有探针LyCl（20μM）的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入不同浓度HClO（20μM）溶液后的荧光光谱变化；（b）探针LyCl（20μM）在I580/I690处的荧光强度与不同浓度的HClO（0-150μM）的滴定曲线以及与HClO（20-120μM）线性关系；（c）（λex=460nm）

(3)pH效应

为了探究pH值的变化是否会干扰探针对HClO的荧光响应，记录了不同pH值下探针的荧光发射强度比率变化。从图4可以看出，在没有HClO的情况下，探针在2.0到6.0的pH范围内是稳定的，7.4到12.0略有增长。而在HClO存在的条件下可以看出，在酸性条件下荧光强度比率几乎无变化，在7.4到12.0的pH范围内荧光强度比率有一个明显的增加，因此，探针LyCl也适合检测生物体内的HClO。

图4 在是否存在HClO（120μM）的情况下，不同pH下的荧光发射强度比值I580/I690的变化（λex=460nm）

(4)荧光响应时间的研究

为了更好地了解探针与HClO的反应，监测了探针的荧光光谱的时间依赖性，如图所示。这些结果表明，当溶液中存在HClO时，690nm处的荧光发射峰逐渐降低，580nm处的荧光强度逐渐增强，荧光比率信号I580/I690能够在10s内达到稳定状态。这意味着我们提出的探针将成为一种快速检测HClO的分析方法。

图5 （a）向含有探针LyCl（20μM）的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM）溶液后记录不同时间的荧光光谱；（b）向含有探针LyCl（20μM）的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（0μM和120μM）后荧光发射强度比值I580/I690随时间的变化关系（λex=460nm）

(5)机理研究

为了探究体系的响应机理，在探针LyCl（20μM）的PBS缓冲溶液（10mM，pH=7.4）中加入HClO（120μM），并进行了质谱分析。在质谱图中，m/z=229.09处有一个片段，这个认为是探针LyCl与HClO响应后的产物Ly-OH（如图7）。另外，同时做了探针LyCl与HClO响应后的荧光光谱和Ly-OH的荧光光谱，如图6（b）所示，对比发现两个荧光光谱均在580nm处有一个发射峰，可以说明探针LyCl与HClO响应后的产物是Ly-OH。根据上述结果，我们提出了响应机制（图6b）。HClO首先攻击C=C键，然后形成的中间体被H2O/HClO进一步亲核攻击，接着进行消除，释放出Ly-OH，导致荧光发射蓝移，荧光增强。

图6 （a）探针LyCl与HClO的响应机理；（b）Ly-OH的荧光光谱以及探针LyCl与HClO响应后的荧光光谱（λex=460nm）

图7 探针LyCl与HClO的响应后的高分辨质谱图

3.结论

综上所述，我们开发了一种比率型次氯酸荧光探针，基于分子内电荷转移机制（ICT），探针与HClO作用后，呈现出较大的蓝移和较高的荧光比率变化，具有高选择性和高灵敏度。我们还证明了探针对HClO表现出线性比率荧光响应，在中性pH条件下，其荧光信号在0～120μM次氯酸浓度范围内呈现良好的线性关系，其检测限为26.5μM。研究结果为设计其他生物分子的检测提供了有益的参考。