联合检测ANXA2和RACK1在肝细胞肝癌预后判断中的价值*

邱婷婷 周梦 肖明兵 瞿利帅 倪润洲 刘金霞

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是癌症死亡的第三大原因[1]。多数患者早期无明显症状且缺乏有效的筛查方法，发现时大多已失去手术机会。肝癌患者高死亡率和预后不良的现状与缺乏早期筛查手段、晚期治疗靶标密切相关[2]，因此，迫切需要研发新型生物标志物用于肝癌的诊断和治疗预后评估。

ANXA2 是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，在癌症的进展中发挥极其重要的作用[3]。ANXA2可通过与t-Pa和S100A10结合激活纤溶系统，增强肿瘤的侵袭性[4]。此外，ANXA2在肿瘤微环境中通过调节与细胞运动相关的微结构的重塑，在肿瘤转移中发挥重要作用[5]。ANXA2也可以通过促进新生血管的形成影响肿瘤的进展[6]。ANXA2有助于维持肿瘤细胞的恶性表型，促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。

RACK1是Trp-Asp (tryptophane-asparagine）重复序列家族的成员，是一种可影响肿瘤进展的多功能支架蛋白，广泛存在于各种真核生物中[7-8]。RACK1可通过促进 ANXA2 Tyr23（tyrosine 23）磷酸化增强耐药性乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力[9]。迄今为止，联合检测ANXA2 和 RACK1在HCC组织中的表达及意义鲜见报道。

本研究 ANXA2 和 RACK1 在HCC及癌旁组织中的表达水平，探讨两者的表达与患者临床特征及预后的关系，并进一步分析联合检测在HCC患者预后判断中的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集自2010年1月至2011年12月在南通大学附属医院行HCC根治性切除术100例患者的HCC石蜡标本。所有患者术前未进行化疗、放疗或者其他治疗，且手术切除标本病理诊断明确，具有完整的临床病理资料，切缘均＞1 cm。100例患者中，男性82例，女性18例；年龄28～64 岁，中位年龄 53 岁。根据Edmondson 分级系统，将肿瘤的组织学分级分为高分化、中分化和低分化[10]。肿瘤-淋巴结转移（TNM）分期根据2010 AJCC HCC 分期系统定义[11]。肝细胞癌患者的临床和病理诊断符合美国肝脏病学会的诊断标准[12]。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学 将HCC及癌旁组织石蜡包埋制成组织芯片，经过烘片、脱蜡和水化后，浸泡在枸橼酸钠缓冲溶液中，高压锅热修复约10 min，冷却至室温后，PBS 冲洗后滴加封闭液，室温 2 h。将组织芯片与小鼠一抗ANXA2 抗体（1∶1 000，购自美国Santa公司）RACK1抗体（1∶50，购自美国Abcam公司）在4℃孵育过夜。用 PBS 洗涤后，以 1∶2 500 的稀释度滴加二抗，孵育 15 min，并用 PBS 洗涤后DAB显色，用苏木精进一步染色，将组织芯片依次放于0.1%HCL分化，梯度酒精、二甲苯脱水，中性树胶封片镜检。

1.2.2 结果判定 在HCC细胞质中可检测到 ANXA2 和 RACK1 染色为阳性，呈黄色和棕黄色颗粒。通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）结果中阳性细胞的百分比和阳性染色强度的组合来评估ANXA2 和 RACK1 的表达水平。染色强度评分：无染色为0分，浅黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，棕褐色染色为3分。根据阳性染色细胞的百分比，将染色程度分为5个等级：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%）和 4分（76%～100%）。强度和范围得分的相乘被认为是免疫组织化学的总得分。基于上述标准，将具有 ANXA2 或RACK1表达的组织分为两组：低表达（0～3分）和高表达（4～12分）。

1.3 统计学分析

使用 SPSS 23.0软件进行统计学分析。通过χ2检验评估ANXA2和RACK1的表达水平与临床特征之间的相关性。多因素 Cox 比例分析用于评估潜在的预后和复发因素，并计算 95%的可信度区间（CI）。使用 Kaplan-Meier 生存曲线评估 ANXA2 和 RACK1与预后的相关性。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者特征

本研究共包括100 例经病理确诊为肝细胞癌的患者。

2.2 ANXA2 和 RACK1 的表达

本研究选择了100对肝癌组织和邻近的正常组织进行IHC分析。在100例组织中，ANXA2在HCC组织中的表达（42%）明显高于邻近正常组织（11%，P＜0.001），RACK1在HCC组织中的表达（38%）明显高于邻近正常组织（18%，P=0.002）。IHC结果表明，ANXA2和RACK1在HCC组织中主要定位于细胞质，染色呈棕黄或棕褐色，两者在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.001，P=0.002），且随着肿瘤组织学分级的增高，表达强度逐渐增加（表1，图1）。

图1 免疫组织化学检测ANXA2和RACK1在HCC组织和对应的癌旁组织中的表达 （IHC×400）

表1 ANXA2 和 RACK1 的表达与临床特征之间的关系 例

2.3 ANXA2 和 RACK1 表达与临床病理特征相关性

根据ANXA2和RACK1表达情况，分为低表达和高表达组，进一步分析 ANXA2 和 RACK1 的表达与临床病理特征之间的相关性（表1）。结果显示ANXA2 表达强度与 AFP（P=0.027）、肿瘤大小（P=0.018）、脉管癌栓（P=0.035）、肿瘤分化（P＜0.001）和 TNM 分期（P＜0.001）间差异具有统计学意义，与性别、年龄、肿瘤数目、HBV 感染、Child 分级和肝硬化等因素均无统计学意义（均P＞0.05）。此外，RACK1表达与肿瘤分化（P＜0.001）、脉管癌栓（P=0.009）和TNM 分期（P＜0.001）间差异具有统计学意义，与其他临床病理特征之间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。进一步分析 ANXA2 和 RACK1的共表达与临床病理特征之间的关系，结果表明ANXA2/RACK1 的高表达与肿瘤分化（P＜0.001）、TNM 分期（P＜0.001）和脉管癌栓（P=0.035）相关。双变量Kendall检验结果显示，ANXA2和RACK1的表达水平存在显著的正相关（Z=0.419，P＜0.01）。

2.4 ANXA2 和 RACK1 表达对HCC患者预后的影响

经Kaplan-Meier法分析，ANXA2 和 RACK1高表达组患者生存率明显降低，两者在HCC中的高表达与患者总生存率的降低相关（P＜0.05，图2A）。且ANXA2-/RACK1-患者的总体生存率显著高于ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2+/RACK1+的患者（图2A）。因此，联合检测ANXA2 和RACK1 的表达在患者预后分析中具有重要临床意义。单因素分析提示脉管癌栓（P=0.002）、肿瘤分化（P=0.015）、TNM 分期（P＜0.001）、ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2/ RACK1共表达（P＜0.001）与患者总体生存时间相关。多因素分析提示ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2 /RACK1 的共表达（P=0.043）是预测总体生存时间的独立预后因素。因此，ANXA2/RACK1联合表达的增加与肝细胞癌患者预后不良相关。

2.5 ANXA2和RACK1的表达对HCC患者复发的影响

ANXA2/RACK1 高表达患者累积复发率高于低表达ANXA2/RACK1患者（PANXA2＜0.001，PRACK1＜0.001，图2B）。提示ANXA2和RACK1促进肝细胞癌患者的复发。在 12 例早期复发患者（复发时间＜12个月）中，11 例高表达 ANXA2（11/12，91.7%）和RACK1 (11/12，91.7%，表2）。与 ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2-/RACK1-患者相比，ANXA2+ /RACK1+患者总是伴随更早的复发（图2B）。单因素分析显示脉管癌栓（P=0.008）、肿瘤分化（P=0.011）、TNM 分期（P＜0.001）、ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）和 ANXA2/RACK1共 表 达（P＜0.001，表2）与复发时间相关。多因素分析显示ANXA2（P＜0.001）、RACK1（P＜0.001）以及ANXA2/RACK1 的共表达（P=0.008）是预测复发时间的独立因素（表3）。 ANXA2/RACK1的共表达是预测HCC患者总体生存和复发时间的独立预后因素，且两者的联合检测可SS以更好地预测患者的生存及复发（表4）。

表2 肝癌患者总生存时间及复发时间的单因素分析

表2 肝癌患者总生存时间及复发时间的单因素分析 （续表2）

表3 肝癌患者总生存时间及复发时间的多因素分析

表4 ANXA2和RACK1的表达与复发之间的关系

图2 ANXA2和RACK1不同表达的HCC患者生存与复发情况

3 讨论

肝细胞癌患者具有较高的发病率和高死亡率[13]。研究表明不同的细胞信号转导途径参与了HCC的细胞增殖、凋亡、分化和转移，包括Wnt/β-Catenin 途径、Ras/Raf/MAPK途径、PI3/AKT/ mTOR 途径和 JAK/STAT 途径等[14-16]。靶向治疗通过抑制HCC中的特定分子及其下游信号通路而发挥抗肿瘤作用[17]。索拉非尼在延长晚期HCC患者的寿命中起重要作用，是临床上广泛使用的代表性靶向药物，其通过阻断生长因子的酪氨酸激酶受体发挥抗肿瘤作用[18]。因此，寻找在HCC发生发展中起作用的新型基因，探寻其对预后的价值以及新的治疗靶点具有重要临床意义。本研究初步探讨ANXA2/RACK1在HCC组织中的表达水平与患者的临床病理因素之间的关系，分析两者联合检测在患者预后判断中的价值。

ANXA2广泛分布于细胞质膜下、核内、细胞外基质及储存离子的细胞器周围，在不同物种中的结构高度保守[19]。ANXA2 结构上包含3个功能不同的区域，其中N端具有 Ser11（serine 11）、Ser25 和 Tyr23磷酸化位点，这3个不同的位点磷酸化后发挥不同的功能，共同促进肿瘤进展[20-21]。Tyr23磷酸化后，促进STAT3入核加快乳腺癌细胞的增殖和转移，且通过与RACK1 相互作用来调节乳腺癌的多重耐药性[22-23]有趣的是，ANXA2存在HCC和肝硬化组织中，而磷酸化 ANXA2 仅在HCC组织中检测到，其潜在机制需要进一步研究[22]。

RACK1具有7个WD40 重复的螺旋桨结构，与G蛋白β亚基具有高度同源性，可作为支架蛋白发挥作用，与激酶、受体和病毒相互结合，参与各种细胞生物学应答[24]。RACK1与 FAK 和三维纤维胶原蛋白基质中的细丝蛋白、波形蛋白相互作用，促进肿瘤血管生成[25]。进一步研究表明RACK1 作为介导细胞相互作用的信号桥，通过与Src相互作用促进ANXA2的磷酸化，即ANXA2 酪氨酸磷酸化由Src介导以RACK1依赖的方式进行，进而促进耐药性乳腺癌细胞的侵袭和迁移[26-27]。

本研究通过免疫组织化学和蛋白质印迹分析，发现 ANXA2 和 RACK1 在肝细胞癌中过表达，多因素Cox 回归分析表明ANXA2、RACK1 和 ANXA2/RACK1高表达是预测患者总体生存时间的独立预后因素，ANXA2、RACK1 和 ANXA2/RACK1 高表达有助于对复发时间的预测。Kaplan-Meier 生存分析结果显示，ANXA2-/RACK1-患者的总体生存率显著高于ANXA2 +/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2+/RACK1 +的患者，与ANXA2+/RACK1-、ANXA2-/RACK1+和ANXA2-/Rack1-患 者 相 比，ANXA2+/RACK1+患者易于更早期复发。

综上所述，本研究结果提示ANXA2/RACK1与HCC患者预后不良和早期复发密切相关，是HCC基因治疗潜在的靶点。但是ANXA2协同RACK1参与HCC发生发展的具体分子机制仍需要在HCC细胞系中进行深入研究。