饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃微生态的影响

2022-04-15杨德智王晨侯明杰王虎成

草业学报 2022年4期

杨德智，王晨，侯明杰，王虎成

（1.庆阳市畜牧技术推广中心，甘肃庆阳 745000；2.兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州 730020；3.甘肃民族师范学院，甘肃合作 747000）

近些年来，由于我国经济水平的快速发展，人们生活水平的提高，以及羊肉所具有的高蛋白、低胆固醇等优良特性，对羊肉的需求量逐年增长［1］，因此养羊业的发展面临着良好的机遇，但是传统的饲养方式已经不能满足羊肉的消费需求。在国家政策引领和经济利益调节下，养羊业由传统的牧区、半牧区逐步向饲草资源丰富的农区转移［2-3］。并且随着肉羊规模化、集约化养殖程度的深入，干草、秸秆等农副产品饲料资源因缺乏科学的开发和处理，没有得到合理充分的应用［4］。而青贮型饲粮可有效保存饲粮养分、适口性好，是优质的粗饲料来源，可有效缓解传统饲料在饲喂肉羊中存在的问题。甜高粱（Sorghum bicolor）原产于非洲，耐干旱、耐贫瘠、饲料转化率高，具有广泛的用途，是重要的糖料及饲用作物，已在我国西北地区得到推广种植［5-6］。研究发现用甜高粱青贮饲喂奶牛，其饲喂效果相当于或优于玉米（Zea mays）青贮［7］；邰发红等［8］用甜高粱青贮和玉米青贮对比饲喂肉牛，结果表明甜高粱青贮能满足肉牛对优质饲草的需求，降低成本，增加经济效益。杜泊羊是原产于南非的一个肉用绵羊品种，于20世纪90年代引入我国，具有抗病力强、耐粗饲、高产、抗逆性强等特点［9-10］，是黄土高原丘陵沟壑地区重要的肉羊品种。由瘤胃、网胃和瓣胃构成的前胃是反刍动物进行物理消化和微生物消化的主要部位。网胃的主要功能是能够过滤筛选食入饲料中的异物，并存在其中；瓣胃能够继续磨细食糜，将较稀的部分输送到皱胃，并吸收大量的酸和水分。由于前胃样品收集的难易程度不同，大多数研究都集中在对瘤胃微生态的研究［11-14］，而网胃和瓣胃也是反刍动物重要的消化器官，但对其研究较少，并且以甜高粱青贮为粗饲料在肉羊育肥中的可行性以及对其健康的影响鲜有报道，探究甜高粱青贮对肉羊前胃微生态的影响，对进一步提高饲料资源的有效利用具有重要的意义。鉴于此，本研究旨在揭示前胃微生态对青贮型饲粮的响应，为甜高粱青贮育肥肉羊提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验饲粮

饲用甜高粱青贮料购自甘肃省机械研究院，全株玉米青贮料和苜蓿（Medicago sativa）颗粒购自甘肃民祥牧草有限公司，本研究所用饲料的详细养分参数见文献［15］。其中，饲用全株玉米青贮和甜高粱青贮的干物质（dry matter，DM）含量（风干基础）分别为94.15%和96.92%；粗蛋白（crude protein，CP）含量分别为41.7和37.3 g·kg-1DM；中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量分别为557.0和672.5 g·kg-1DM；酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量分别为339.0和416.1 g·kg-1DM；木质素（lignin）含量分别为19.0和32.2 g·kg-1DM；淀粉含量分别为81.3和18.0 g·kg-1DM。

1.2 试验动物及其管理

选取3～4月龄杜泊母羊［（33.40±1.68）kg］14只，进行饲养试验，预饲期15 d，正试期90 d，共计105 d。根据饲喂青贮料的不同，随机分为2组，分别为甜高粱青贮组（SS组，甜高粱青贮+试验羊体重1%的精料及0.5%的苜蓿颗粒）和玉米青贮组（CS组，全株玉米青贮+试验羊体重1%的精料及0.5%的苜蓿颗粒），每组7只羊，每只羊为1个重复。试验羊自由采食并饮水，每天8：00和17：00饲喂两次，称重记录给料量和剩料量，并采集饲料样品，用以测定和计算日粮采食量（dry matter intake，DMI），试验开始时以及试验第30、60和90天对母羊进行称重，计算两组羊的平均日增重（average daily gain，ADG）和料重比（the ratio of feed to gain，F/G，干物质采食量和平均日增重的比值）。

1.3 采样方法及测定指标

正试期结束后，每组选取体况相近的4只羊进行屠宰，所有羊在屠宰前禁食24 h和禁水2 h，屠宰后分离出消化道，立即将前胃各部分分段并结扎。用4层纱布过滤收集瘤胃、网胃和瓣胃内容物各2份，用笔式SX620型pH计测定pH后，1份置于液氮中，用来提取前胃微生物DNA；另1份加入HgCl2，保存在-20℃冰箱中，待测前胃发酵参数。取瘤胃背囊，网胃和瓣叶组织去食糜拍照后剪取前胃各部位组织样品1 cm2（1 cm×1 cm），置于4%的中性福尔马林固定液中保存固定，用以制作组织切片。

1.3.1前胃发酵参数按照冯宗慈等［16］比色法测定氨氮（ammonia nitrogen，NH3-N）浓度。按照曾钰等［17］的方法采用Aglient 6890N气相色谱仪（色谱柱FFAP30 m×0.32 mm×0.5μ）测定挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）含量。

1.3.2前胃微生物DNA的提取及测序前胃内容物微生物DNA的提取利用Omega Stool DNA试剂盒，参照试剂盒操作说明进行提取。细菌荧光定量引物序列（5′-3′）见表1。RT-PCR反应体系为25μL，包括SYBR®Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase H Plus）12.5μL，PCR Forward Primer 1.0μL，PCR Reverse Primer 1.0μL，DNA模板2.0μL，并用双蒸水（8.5μL）补至终体积为25μL。将PCR扩增反应程序设置为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后72℃延伸5 min，PCR产物4℃保存。

表1 前胃微生物RT-PCR引物Table 1 For estomach microor ganisms RT-PCR pr imer

1.3.3前胃上皮颜色观察和组织结构测定取瘤胃背囊，网胃和瓣叶组织，平铺后选取3个不同部位，用国产精密色差仪（WR-18）测定亮度，取均值计算。已固定的前胃组织经水洗、酒精脱水、透明、石蜡包埋、冷冻、切片、染色和封片等程序进行处理［22］。利用光学显微镜观察与测量瘤胃背囊、网胃和瓣胃组织形态学，具体包括以下指标。瘤胃背囊：乳头长度、乳头宽度、黏膜上皮厚度、黏膜下层厚度和肌层厚度；网胃：黏膜厚度、黏膜下层厚度和肌层厚度；瓣胃：黏膜上皮厚度、中央肌层厚度和瓣叶肌层厚度。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010初步整理试验数据，然后用SPSS 24.0统计软件中独立样本t检验进行分析，试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著水平，P＞0.05表示组间无显著差异。采用2-△△CT法计算前胃细菌的相对表达量，对照为瘤胃各细菌的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊生长性能的影响

CS组肉羊的日采食量和平均日增重显著高于SS组，而料重比显著低于SS组（表2）。

表2 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊生长性能的影响Table 2 Effects of sweet sorghum and whole-plant corn silage on the growth performance of mutton sheep

2.2 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃发酵参数的影响

甜高粱青贮和全株玉米青贮育肥肉羊90 d后，对瘤胃、网胃和瓣胃的p H值未产生显著影响（P＞0.05）。在网胃内容物中，SS组肉羊氨氮浓度显著（P＜0.05）高于CS组，CS组肉羊丁酸含量显著（P＜0.05）高于SS组。SS组肉羊瘤胃总挥发性脂肪酸含量显著（P＜0.05）高于CS组（表3）。

表3 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃发酵参数的影响Table 3 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on fer mentation parameters of for estomach in mutton sheep

2.3 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃微生物表达量的影响

SS组肉羊瘤胃内短普雷沃氏菌、栖普雷沃氏菌、产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的表达量显著（P＜0.05）高于CS组（表4）。SS组肉羊网胃内溶纤维丁酸弧菌、栖普雷沃氏菌、产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的表达量显著高于CS组（P＜0.05）。CS组肉羊瓣胃内短普雷沃氏菌和黄色瘤胃球菌的表达量显著高于SS组（P＜0.05），但SS组肉羊瓣胃内产琥珀酸丝状杆菌的表达量显著高于CS组（P＜0.05）。

表4 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃微生物表达量的影响Table 4 Effects of sweet sorghum and whole-plant corn silage on microbial expression of forestomach in mutton sheep（%）

2.4 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃上皮颜色的影响

较大的数值表示上皮颜色较浅，而较小的数值表示上皮颜色较深（表5）。饲粮处理显著影响前胃颜色，CS组肉羊的前胃上皮颜色比SS组深（P＜0.05）。

表5 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃上皮颜色的影响Table 5 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on the color of forestomach epithelium in mutton sheep（亮度L*）

2.5 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃组织结构的影响

SS组肉羊瘤胃乳头宽度显著（P＜0.05）高于CS组（表6），甜高粱青贮和玉米青贮对肉羊网胃黏膜厚度、黏膜下层厚度和肌层厚度并未产生显著影响（P＞0.05），CS组肉羊的瓣胃黏膜上皮厚度显著高于SS组（P＜0.05）。

表6 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃组织结构的影响Table 6 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on the tissue structur e of for estomach in mutton sheep（μm）

3 讨论

3.1 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊生长性能、前胃发酵参数和微生物表达量的影响

Brunette等［23］研究表明，动物对粗纤维含量高的饲粮消化率会相应降低；同样，张霞等［15］的研究结果也表明，肉羊对玉米青贮的采食量与甜高粱青贮相比要高，可能是由于甜高粱青贮的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量高，适口性较差，降低了消化率；在本试验中，CS组肉羊的生长性能指标显著高于SS组，与上述结果一致。

p H、NH3-N和VFA可以反映前胃内环境发酵状况以及饲料的发酵模式和程度［24］。在本试验中羊的前胃p H变动范围为6.13～7.13，正常范围为5.5～7.5［25］，说明饲喂这两种青贮料未使肉羊的前胃p H产生异常，与之前的研究结果一致［26］。氨氮浓度能够直接反映前胃中微生物的生长状况以及微生物对饲粮蛋白质的合成利用，有研究报道，最适合瘤胃微生物生长的氨氮范围为10～50 mg·d L-1［27］，本试验中肉羊的前胃氨氮浓度处在正常波动范围内。VFA是反刍动物降解日粮中的碳水化合物而产生的，同时也是重要的能量来源，能为反刍动物提供所需能量的70%～80%［28］。在本研究中，SS组肉羊瘤胃TVFA含量显著高于CS组，表明甜高粱青贮通过瘤胃微生物消化后产生了更多的能量物质，可能是全株玉米青贮和甜高粱青贮相比淀粉含量（81.3 VS 18.0 g·kg-1DM）较高，在瘤胃内迅速发酵产酸使pH降低，对某些纤维型碳水化合物的降解产生了抑制［29］。另外在本试验中，SS组肉羊瘤胃内产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的表达量显著高于CS组，这两种菌均为纤维分解菌，且甜高粱青贮料中性洗涤纤维（672.5 g·kg-1DM）、酸性洗涤纤维（416.1 g·kg-1DM）和木质素（32.2 g·kg-1DM）的含量高于全株玉米青贮料中性洗涤纤维（557.0 g·kg-1DM）、酸性洗涤纤维（339.0 g·kg-1DM）和木质素（19.0 g·kg-1DM）含量，因此TVFA存在显著差异。网-瘤胃的节律性收缩运动，使瘤胃食糜内容物向胃肠道后段推移［30］，本试验中CS组肉羊网胃内丁酸含量显著高于SS组，可能是由于玉米青贮料淀粉含量较高。

反刍动物的前胃特别是瘤胃内有大量发酵消化饲粮的微生物，能将饲料消化分解使机体吸收，对于维持内环境的稳定和动物的健康至关重要［31］。普雷沃氏菌是拟杆菌门中的普雷沃氏菌属中重要的淀粉降解菌，能够对淀粉、果胶等非纤维性碳水化合物进行降解，但是不能利用纤维素，有些栖普雷沃氏菌对燕麦（Avena sativa）中的木聚寡糖有很强的降解能力，普雷沃氏菌也是重要的蛋白降解菌，且短普雷沃氏菌的蛋白酶活性最高［28］。在本试验中，甜高粱青贮料粗蛋白含量（37.3 g·kg-1DM）虽然低于全株玉米青贮料（41.7 g·kg-1DM），但是本研究结果表明SS组肉羊瘤胃内短普雷沃氏菌和栖普雷沃氏菌的相对表达量显著高于CS组，暗示可能发酵所产生的环境更适合于这两种蛋白降解菌的生长。产琥珀酸丝状杆菌、瘤胃球菌如白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌等为反刍动物前胃内主要的纤维降解菌［28］，Thoetkiattikul等［32］研究表明，动物采食高纤维饲粮时的纤维降解菌的表达量较高。另有研究表明，桑枝（Morus alba）叶粉饲喂云南云岭牛组的产琥珀酸丝状杆菌数量显著多于基础饲粮组［33］。本研究中，SS组肉羊前胃内产琥珀酸丝状杆菌的表达量显著高于CS组，可能由于这两种青贮料的粗纤维含量不同所致。

3.2 饲用甜高粱和全株玉米青贮对肉羊前胃上皮颜色和组织结构的影响

本研究发现用甜高粱青贮和玉米青贮饲喂肉羊时，前胃颜色明显不同，CS组肉羊前胃上皮颜色较深，SS组颜色较浅。有研究发现，瘤胃发酵情况、动态变化、上皮的角质化程度以及上皮细胞健康状况均能够通过反刍动物瘤胃上皮颜色得以反映，且会受日粮矿物质组成的影响［34］。当反刍动物采食高精料饲粮时，大量产酸，瘤胃上皮细胞的代谢和增殖速率显著加快，会导致细胞过早过渡到角质层，出现瘤胃上皮角化不全的现象［35-36］。Blanco等［37］研究发现，饲喂精料组美利奴羔羊的瘤胃上皮颜色要比饲喂紫花苜蓿组的颜色深。王龙［38］研究表明，高精料饲粮可导致瘤胃上皮颜色变黑变深。饲喂高能量饲粮比饲喂低能量饲粮时瘤胃颜色深，可能由于高能量饲粮在瘤胃内发酵迅速，产酸过多对上皮的刺激所致［39］；且瓣胃上皮对丁酸有较强的吸收能力［40］。在本试验中，全株玉米青贮料的淀粉含量（81.3 g·kg-1DM）和甜高粱青贮料（18.0 g·kg-1DM）相比较高，可能会导致前胃上皮角化不全，因此CS组肉羊前胃上皮颜色较深，而饲喂甜高粱青贮时，肉羊前胃上皮颜色较浅，更有利于肉羊健康。

反刍动物的前胃无腺体，前胃上皮角化层的厚度、肌层厚度以及黏膜乳头的特征的改变会因不同的饲养条件而发生改变［28］。瘤胃乳头的形态学结构对瘤胃上皮的营养物质吸收以及离子的转运能力有决定性作用，且瘤胃乳头长度和宽度均是评价瘤胃发育程度的重要指标［41-42］。孔令强［43］的研究结果表明，犊牛瘤胃乳头的长度、宽度随着精料的增加而逐渐增加。于洋等［44］研究放牧与舍饲阿尔巴斯白绒山羊母羊胃肠道组织形态的变化，结果表明舍饲育肥组母羊的瘤胃乳头长度和宽度显著高于放牧组。而张双奇等［45］研究发现，瘤胃乳头长度与粗饲料的摄入量呈负相关，肉羊随采食精饲料的增加瘤胃乳头宽度显著降低。在本试验中用甜高粱青贮和全株玉米青贮料饲喂肉羊90 d后，SS组肉羊的瘤胃乳头宽度显著高于CS组，表明甜高粱青贮能够促进肉羊瘤胃的组织形态发育，可能与甜高粱青贮中粗纤维和木质素等含量高于玉米青贮，与这两种青贮料的营养物质含量不同有关。

此外，在本试验中，CS组肉羊的网胃黏膜厚度、黏膜下层厚度和肌层厚度与SS组相比无显著差异，周力等［46］指出，当饲粮精料含量较高时，会在瘤胃内发酵产生大量的丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，丁酸含量的不断增加会导致网胃角化不全，不利于网胃的生长发育。甄玉国等［47］研究发现，随着日粮粗饲料水平的增加，山羊、绵羊的瓣胃的角化层厚度也相应增加，可能与一定水平的粗纤维对瓣胃的刺激有关。但本试验结果表明，玉米青贮组的瓣胃黏膜上皮厚度的值显著大于甜高粱青贮组，与前人研究结果不一致，有待进一步探讨。