白东魁和东魁不同发育阶段果实花青苷组分及含量差异分析

林旗华，钟秋珍，张泽煌

(福建省农业科学院果树研究所，福州，350013)

杨梅Myricarubra为杨梅科杨梅属植物，是中国特色果树之一，在我国栽培历史悠久，主要分布于长江流域以南、海南省以北的山地，以浙江、福建等地为主[1-3]。与葡萄和柑桔等大宗果树相比，杨梅种植面积和产量相对较小，中国杨梅种植面积约30万hm2[4]。

杨梅果实色泽通常依据果实中花青苷含量及类别的差异可分为白色、红色、深红色、紫红色和紫黑色等[2，5-6]。东魁杨梅果实紫红色，研究杨梅资源过程中，我们在东魁杨梅群体中发现了1个粉色果实的杨梅变异株系，暂定名为白东魁；其植株形态、叶片形状及物候期等与东魁杨梅相同，成熟果实浅粉红，与东魁杨梅及其他杨梅品种存在显著性差异，具有较好的推广应用价值[7]。因此本研究分析了东魁和白东魁3个不同发育阶段果实花青苷组分及相对含量，为阐述其色泽形成及推广应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

漳州市龙海市浮宫镇杨梅园12年生东魁，砧木为野生杨梅，白东魁为同批次东魁高接换种植株，在幼果期(花后55 d)、转色期(花后70 d)和成熟期(花后85 d)3个不同发育阶段采样。两个品种(系)各选择树势及结果情况较一致植株3株，每株采集果实20个，为3次重复，果实采摘后迅速切取果肉放置于冻存管中，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 样品提取 样品真空冷冻干燥后，利用研磨仪研磨至粉末状，称取粉末100 mg，溶解于1.0 mL提取液(70%甲醇水溶液)中，溶解后的样品4 ℃冰箱过夜，期间涡旋3次，提高提取率；转速10 000×g离心10 min后，吸取上清液，用微孔滤膜(孔径0.22 μm)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 色谱质谱采集 数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，http：//www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP，http：//www.appliedbiosystems.com.cn/)。

1.2.3 花青苷的定性与相对定量 基于自建数据库MWDB(metware database)及代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。其中部分物质定性，分析时去除同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子重复信号。花青苷种类结构解析参考了MassBank(http：//www.massbank.jp/)、KNAPSAcK(http：//kanaya.naist.jp/KNApSAcK/)、HMDB(http：//www.hmdb.ca/)、MoTo DB(http：//www.ab.wur.nl/moto/)和METLIN(http：//metlin.scripps.edu/index.php)等已有的质谱公共数据库[8]。相对定量利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成，相对计量单位为收集到的光子个数/s。

1.2.4 花青苷含量定量分析 花青苷含量测定参照张泽煌等[6]的方法。

1.2.5 数据分析 采用DPS数据处理系统和Excel分析数据。

2 结果与分析

2.1 花青苷组分分析

从表1可以看出，成熟期的白东魁和东魁果实中均检测出7种花青苷，其中矢车菊素3种，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷和矢车菊素-3-O-鼠李糖苷；飞燕草素2种，分别为飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷；另外2种分别为天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷。在东魁和白东魁的幼果期和转色期均未检测出飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷。

表1 白东魁和东魁杨梅不同成熟期果实色泽及花青苷种类

2.2 不同发育阶段果实花青苷含量变化

2.2.1 矢车菊素类花青苷的变化 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在东魁和白东魁果实3个不同发育阶段均被检测出，在成熟果实中含量最高，分别为4.76×108和6.63×107个光子/s，东魁是白东魁的7.18倍；在幼果期和转色期，其含量东魁分别是白东魁的1.47倍和33.49倍。东魁果实中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量随着果实成熟迅速提升，成熟期的含量分别是幼果期和转色期的65.93倍和7.40倍。白东魁幼果期和转色期果实中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量均较低，成熟期迅速提升。

矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷相似，在东魁和白东魁果实3个不同发育阶段均被检测出，同样在成熟果实中的含量最高，分别为1.21×108和5.42×106个光子/s，东魁是白东魁的22.32倍。在幼果期东魁和白东魁的矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷均维持在较低水平，东魁是白东魁的0.89；在转色期东魁的矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷加速积累，达到白东魁的45.81倍。东魁果实中矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷的含量随着果实成熟迅速提升，成熟期的含量分别是幼果期和转色期的590.24倍和20.47倍(见图1)。

图1 两个杨梅品种(系)矢车菊素类花青苷含量变化

矢车菊素-3-O-鼠李糖苷含量与其他两个矢车菊素花青苷差别之处在于成熟果实中白东魁的含量高于东魁，是东魁的1.38倍，分别为2.39×107和1.73×107个光子/s。矢车菊素-3-O-鼠李糖苷同样在东魁和白东魁果实3个不同发育阶段均被检测出，成熟果实中含量最高；在幼果期和转色期，东魁中含量分别是白东魁的1.48倍和18.26倍。东魁果实中矢车菊素-3-O-鼠李糖苷含量在果实转色期迅速提升，之后缓慢积累，成熟期的含量为转色期的1.31倍。白东魁与之相反，在成熟阶段迅速累积，成熟期的含量是转色期的33.06倍。

2.2.2 飞燕草素类花青苷的变化 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷与3个矢车菊素花青苷最明显的差异是，其在东魁和白东魁幼果期的含量显著高于转色期，分别是转色期的14.26倍和6.12倍。但在成熟阶段，东魁果实中飞燕草素-3-O-葡萄糖苷含量加速累积，超过了幼果期，达到了1.85×107；而白东魁果实的飞燕草素-3-O-葡萄糖苷含量为3.10×106，仍显著低于幼果期，且只有东魁成熟果实的16.76%。

飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷均只在东魁和白东魁的成熟果实中检出，幼果期和转色期均未检出，东魁成熟果实中的含量是白东魁的10.15倍(见图2)。

图2 两个杨梅品种(系)飞燕草素类花青苷含量变化

2.2.3 其他类花青苷的变化 白东魁和东魁幼果中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量差异较小，东魁为白东魁的1.31倍；在转色期，东魁中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量开始迅速累积，增加了26.21倍，而白东魁不升反降，至成熟阶段才开始加速累积。在成熟果实中，东魁和白东魁的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量分别为6.87×107和3.83×107，东魁是白东魁的1.79倍。

东魁和白东魁幼果中，芍药色素-3-O-葡萄糖苷含量均非常低，基本一致。与天竺葵素-3-O-葡萄糖苷一样，东魁中芍药色素-3-O-葡萄糖苷含量在转色期开始迅速累积，增加了13.44倍；而白东魁基本维持不变，至成熟阶段才开始加速累积。成熟果实中，东魁和白东魁的芍药色素-3-O-葡萄糖苷含量分别为2.15×108和1.72×107，东魁是白东魁的12.50倍(见图3)。

图3 两个杨梅品种(系)两类花青苷含量变化

3 结论与讨论

3.1 杨梅果实花青苷种类分析

花青苷是经由苯丙氨酸代谢途径产生的一类类黄酮化合物，通过糖苷化、羟基化、甲基化和酰基化等形成多种稳定的花青苷，不同色泽杨梅果实间的花青苷含量差异显著[9]。叶兴乾等[10]和张望舒等[11-12]的研究表明，红色和紫黑色等杨梅果实中的花青素以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主，达85%以上，另还有少量的飞燕草色素和天竺葵色素，但未获得具体组分。本研究通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析，共鉴定出7种花青苷，其中矢车菊素3种，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷和矢车菊素-3-O-鼠李糖苷；飞燕草素2种，分别为飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷；另还检测到天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷，而芍药色素-3-O-葡萄糖苷是鲜少在杨梅果实中检测到。本研究丰富了杨梅果实花青苷的研究宽度与深度，为后续深入开展杨梅果实色泽形成的分子调控机理研究以及育种工作打下基础。

3.2 不同品种(系)果实中花青苷种类及含量差异

本研究发现，白东魁成熟果实中，除矢车菊素-3-O-鼠李糖苷外，其他6种花青苷的含量均显著低于东魁，东魁成熟果实中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷、芍药色素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量依次分别是白东魁的7.18倍、22.32倍、12.50倍、10.15倍、5.97倍、1.79倍，推测这是导致白东魁粉色果实最主要的原因。除飞燕草素-3-O-葡萄糖苷外，其他6种花青苷的含量在白东魁和东魁的幼果期含量均极少，转色期加速累积，在成熟期达到最高值，这与牛姗姗[4]和张望舒等[11]对红色类杨梅果实的研究结果基本一致。

飞燕草素-3，5-O-二葡萄糖苷在东魁和白东魁的幼果期和转色期均未检测到，可能在这两个发育阶段，其含量均非常微小，未达到本研究技术检测的阈值。同时，本研究还发现，一是飞燕草素-3-O-葡萄糖苷含量在东魁和白东魁的幼果期即保持在较高水平，显著有别于其他6种花青苷；二是矢车菊素-3-O-鼠李糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷在东魁转色期果实中即迅速累积，区别于其他花青苷，这几种花青苷在杨梅果实发育过程中的调控机制有待于进一步研究。