宽皮柑桔可滴定酸检测方法的对比研究

赵婉彤，薛 杨，孙珍珠，申晚霞，王林学，江 东，赵晓春

(1 西南大学柑桔研究所，重庆，400712；2 重庆市渝北区农业技术推广站，重庆，401120)

柑桔(CitrusL.)是世界上重要的经济作物之一，具有重要的营养价值、药用价值和生态价值[1]。我国是世界上最大的宽皮柑桔生产国，宽皮柑桔产量约为世界总产量的一半[2]。糖、酸含量是决定柑桔果实品质和口感的最重要指标。目前，测定柑桔果实酸含量的方法有多种，我国国家标准《柑桔鲜果检验方法》(GB/T 8210—2011)采用的是基于化学反应的酸碱滴定法[3]。酸碱滴定法较耗时，难以实现对大量样品进行高通量检测[4]。利用基于电导率法的手持快速检测仪可对柑桔果实酸含量进行快速检测，但准确度和精确度较低。近红外光谱分析法具有快速、重复性好、样品几乎无需处理、信息丰富等优点，在农业、食品、化工、医药等领域得到广泛的应用。有机物中的C-H、O-H和N-H化学键对近红外光谱比较敏感，而这些化学键与可滴定酸之间的关系密切，以此为依据可以建立其近红外光谱检测模型。国内外有许多学者对近红外光谱分析法用于果蔬内在品质的无损检测进行了研究[5-8]，如采用偏最小二乘回归法(PLS)建立了梨[9]、宽皮柑桔[10]、苹果[11]、番茄[12]及甜橙[13-15]果实内在品质(包括总酸)的近红外光谱无损检测模型。目前对柑桔果实内在品质进行精准测定的近红外光谱检测建模研究比较少，且已有研究涉及的柑桔品种数和样品数较少，通用性不足。为避免果皮厚度、果面粗糙度、检测角度以及位置等因素对检测精准度的影响，保证取样的代表性和稳定性，笔者以宽皮柑桔果汁为检测对象，建立并优化可滴定酸含量近红外光谱检测的PLS模型，使近红外光谱分析能应用于对柑桔内在品质进行高通量精准检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料与前处理

试验所用240个宽皮柑桔品种[16]的果实采自位于重庆北碚的国家果树种质重庆柑桔圃。每个品种随机采集10个成熟果实用于分析，2015—2016年连续两年进行采样测定，共采集了480份样品。样品前处理：将果实表面擦拭干净，对切，用手动橙汁榨汁器榨汁，果汁经4层纱布过滤。

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠(分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司。酚酞(分析纯)购自重庆川东化工(集团)有限公司。傅里叶变换近红外光谱仪(ThermoAntarisⅡ FT-NIR Analyzer，USA)。PAL-BX/ACID1(PAL-1)柑桔糖酸一体机(ATAGO公司，日本)。

1.3 测定方法及比较

1.3.1 化学法 采用国家标准《柑桔鲜果检验方法》(GB/T 8210—2011)中的指示剂滴定法测定含酸量[3]。在100 mL容量瓶中加入果汁原液10 mL，加蒸馏水定容并摇匀，取稀释液放入锥形瓶中，加1%酚酞指示剂1滴，用已标定的氢氧化钠溶液滴定至溶液转为红色30 s不退色为终点。平行试验3次，取平均值。记录滴定所消耗的氢氧化钠溶液体积，根据消耗的体积计算样品果汁中的可滴定酸含量。

1.3.2 PAL-1法 取1 mL果汁样品稀释50倍至50 mL(加蒸馏水49 mL)，并搅拌均匀。将样品稀释液加入PAL-BX/ACID1的样槽直接检测，每个样品重复测定3次，环境温度17～25 ℃。

1.3.3 近红外光谱法 近红外光谱采集：对480份样品的果汁原液用近红外光谱仪进行检测，每个样品取30 mL搅拌均匀的果汁于烧杯中，将光纤探头完全浸入果汁中，用透射模式重复扫描64次，获得每个样品的光谱，去除30份无效光谱，最终获得有效光谱450份。

光谱预处理与建模：通常光谱仪采集的图谱除包含与待测物质相关的光谱信息外，还含有一些其他成分的干扰谱线和一些环境噪音、样品背景及杂散光的信息，直接使用原始光谱信号进行分析会影响所建模型的准确性[17]。本试验随机选取390个果汁样品作为校正集(建模集)，其余60个果汁样品作为验证集。采用美国Thermo Nicolet 公司的智能定量分析软件TQ Analyst 9.4对这些柑桔样品的原始近红外光谱进行一定的预处理后，再用偏最小二乘回归(PLS)算法[9，13，18，19]将预处理近红外光谱数据与化学方法测量值进行关联分析，建立预测模型，最后用已知基础数据的验证集样品对校正模型进行验证，建立高质量的模型。

模型评价：采用校正均方根误差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、预测均方根误差(Root mean square error of prediction，RMSEP)、相关系数r来判断模型的精准度[20]。

1.3.4 方法比较 以化学法为基准，对比分析近红外光谱法与PAL-1测定法的实际适用情况。

2 结果与分析

2.1 样品可滴定酸含量

化学法测定结果表明，样品可滴定酸(TA)含量范围为0.28%～5.67%(见表1)，呈典型的正态分布，说明选用的样品具有较广泛的代表性。李东华等[21]研究认为，样品化学成分含量范围越大，越有利于提高模型的适用范围。本试验中，验证集样品的可滴定酸含量范围在校正集样品之内，故校正集所建立的模型能较好地适用于验证集。

表1 宽皮柑桔果汁样品的可滴定酸含量

2.2 近红外光谱检测PLS模型

光谱预处理：从多个样品的原始可见-近红外光谱(见图1)来看，光谱的变化趋势非常相似，排除全吸收和零吸收的部分，选取特征波段(波数6 550～5 370 cm-1)光谱参与可滴定酸含量的近红外光谱建模。

图1 多个宽度柑桔(果汁)样品的原始可见-近红外光谱

为剔除相互影响的干扰信号以及噪音，确定分析最佳光谱区间，本试验利用近红外光谱仪自带的分析软件将原始吸收光谱分别进行一阶导数、二阶导数、原始光谱+Norris平滑、一阶导数+Norris平滑、二阶导数+Norris平滑处理，与原始光谱建立PLS模型相比较。通常，预测模型要求有高的相关系数，较小的RMSEC和RMSEP，而且RMSEC和RMSEP之间的差要小，则所建模型的预测精度越高，光谱预处理效果越好[20]。通过对比分析可知，对特征波段(波数范围为6 550～5 370 cm-1)的原始光谱进行不同预处理后建立的PLS模型，除了二阶导数预处理以外，其他预处理方法的相关系数r均达到0.9以上。其中，以一阶导数+Norris消噪光谱预处理的效果最好，所建宽皮柑桔可滴定酸含量近红外光谱检测PLS模型的相关系数为0.986 1，RMSEC为0.096 9，交叉验证均方根误差RMSECV为0.116(见表2)。

表2 光谱预处理方法对宽皮柑桔果汁可滴定酸近红外光谱检测PLS模型的影响

模型验证：内部交互验证(Cross validation)是评价确定数学模型的一种有效方法。用已建立的数学模型对验证集样品(60个)进行预测，预测值和化学方法实测值之间的相关系数为0.981 2，相关性达到了极显著水平(p<0.001)，RMSEP值为0.155(见图2)。这表明，所建数学模型稳定性好，检测、预测效果较好，可以应用。

图2 宽皮柑桔果汁可滴定酸近红外光谱检测PLS模型预测结果(n=60)

2.2 不同测定方法比较

不同方法检测宽皮柑桔果汁样品可滴定酸的数据值如表3所示。可见，近红外光谱法的数据值与化学测定法差距较小，检测误差也较小；PAL-1测定法的数据值与化学测定法相差较大，检测误差也较大。相关性分析结果表明，化学测定法与近红外光谱检测法之间的相关系数为0.991(p<0.001)，化学测定法与PAL-1测定法之间的相关系数为0.979(p<0.001)，近红外光谱法与化学测定法之间的相关性更高。与PAL-1测定法相比，近红外光谱检测法更可靠(见图3)。

图3 不同方法检测宽皮柑桔果汁样品(236份)可滴定酸的相关性

表3 不同方法检测宽皮柑桔果汁样品可滴定酸含量的结果 %

根据可滴定酸含量将样品分为3类进行检测的结果表明，样品可滴定酸含量≤1%时，3种方法的标准差皆最低，说明3种方法在可滴定酸含量≤1%的范围内具有较高的精确度(见表4)。国家标准《鲜柑桔》(GB/T 12947—2008)，要求宽皮柑桔类商品果的可滴定酸含量≤1.0%[22]。可见，以上3种方法对于商品果的检测是可行的。虽然PAL-1法在可滴定酸含量≤1%范围内的标准差最低，但是平均值远高于近红外光谱法和化学法，近红外光谱法与化学法在平均值与标准差方面皆非常相近，因此，与PAL-1法相比，近红外检测法更稳定、精确。由于受消费习惯的影响，市场上的鲜食柑桔的可滴定酸含量均在1.0%以下。为了验证近红外光谱法与PAL-1法对商品果检测的稳定性以及精准度，从样品中选出185个可滴定酸≤1%的样品，对检测结果做进一步的相关性分析。结果表明，近红外光谱法与化学法的相关性为0.845(p<0.001)，PAL-1法与化学法的相关性为0.556(p<0.001)。可见，当样品的可滴定酸≤1%时，近红外光谱法检测的准确度、可靠性和稳定性均高于PAL-1法。

表4 不同方法检测可滴定酸含量范围不同宽皮柑桔果汁样品的结果 %

3 讨论与结论

近红外光谱分析技术的应用非常广泛，在薄皮水果的品质分析上也有较多的应用。目前在柑桔上的应用大多为整果或单一商业品种的模型，通用性不高。柑桔不同于薄皮水果，其果皮较厚，且较粗糙，而且不同品种间果皮厚度的变化非常大，这对利用近红外光谱进行柑桔水果品质的精准检测有较大影响[23]。本试验以液体果汁为样品对果实品质进行分析，可以避免果皮厚度、果面光滑度、采集点等带来的影响，适用范围更为广泛，除可用于检测宽皮柑桔的可滴定酸含量外，也可用于其他类型柑桔如甜橙、柚等果汁可滴定酸含量的测定。同时，近红外光谱法对样品的前期处理方式与化学法一致，利于方法间的比较和方便随时抽检，以保证近红外光谱检测模型的准确性。

本试验采用了多种类型的宽皮柑桔品种为建模样品，品种数量较多，样品范围较广，适用面大。通过近红外光谱的范围选定、预处理对比，选出适合宽皮柑桔果汁可滴定酸含量近红外光谱检测PLS建模的光谱预处理方法，即一阶导数+Norris消噪。通过以化学测定法为基准，将近红外光谱法与PAL-1法进行对比分析，发现两种方法之间均与化学测定法存在极显著的相关性，其中，近红外光谱法更接近化学法，其准确度和精准度均高于PAL-1法。

综上所述，测定柑桔(果汁)可滴定酸时，近红外光谱法与化学法有相同的准确度和精准度，可作为研究数据的测定，而且近红外光谱法具有可进行高通量检测的优势，在对大量样品进行品质表型数据的采集上有较好的应用潜力。