土壤中的草甘膦对枳苗生长及根际土壤有机酸、酶活性及微生物的影响

何 昊，唐白露，王华堂

(湖南文理学院，湖南常德，415000)

柑桔在我国南方农业生产中占据着举足轻重的地位[1]。枳是我国柑桔生产中常用的砧木之一[2]。在柑桔生产中，为了防止杂草生长，会使用草甘膦等除草剂[3-4]。草甘膦如果用量过多或者频繁喷施，很容易在土壤中积累，导致土壤污染，使土壤质量下降[5-6]。如果根据果园中草甘膦使用量(4.48 kg/hm2)来估算，喷施一次后，会有80%以上的草甘膦药液进入土壤，可使表层13 cm土壤的草甘膦含量达到2 mg/kg左右[7]。我国南方地区气候温暖湿润，非常适合各种杂草生长，因此部分果园中草甘膦的实际使用量可能更多，且使用次数也会增加，这将导致土壤中草甘膦积累量增多。草甘膦可以被植物根系吸收并在植物体内积累，最终抑制整个植株的生长。前人利用不同剂量草甘膦处理枳、温州蜜柑、脐橙植株后发现，高剂量的草甘膦会对新梢产生毒害作用，并抑制根系对土壤养分的吸收[4，8-9]。虽然草甘膦对柑桔植株的危害已经受到关注，但是关于草甘膦对柑桔根际环境的影响仍鲜见报道，尤其是草甘膦对柑桔根际土壤有机酸含量、土壤酶活性以及微生物的影响尚不明确。根际土壤有机酸主要来源于植物根系分泌物，是调控根际生物和非生物互作的重要因子[10-12]。根际土壤酶活性和根际微生物群落更是与植物的健康生长息息相关[13-15]。本试验以此为切入点，通过使用不同剂量的草甘膦处理柑桔砧木枳幼苗，观察其对枳幼苗生长的影响，以及对根际土壤有机酸、酶活性和微生物的作用，探明草甘膦对枳苗根际环境的危害，以期为草甘膦污染土壤的修复以及草甘膦的规范使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 枳幼苗 选饱满枳种子，先用25 ℃温水浸泡24 h，再埋入蛭石中，置于25 ℃培养箱中培养，待种子萌发，幼苗生长至10 cm左右，挑选长势一致的枳幼苗进行盆栽。

1.1.2 供试土壤 种植枳苗所使用的土壤取自湖南文理学院生物园中闲置的已开垦地块，且5年内没有种植过柑桔和其他作物，仅有马唐草、马齿苋等杂草生长。采用五点法取土，取土深度为10～30 cm(去除表层10 cm的土壤)，将所取土壤弄碎平铺于室内地面，去除碎石及其他杂质，自然风干后过0.5 cm网筛，再与一定量泥炭和蛭石按体积比3∶1∶1混合均匀，用于枳苗盆栽种植。试验所用园土的有机质为25.79 g/kg，碱解氮为66.88 mg/kg，有效磷为51.02 mg/kg，有效钾为63.61 mg/kg，pH值为6.76。

1.2 方法

1.2.1 草甘膦处理设计 设5个处理，即在盆栽基质中添加不同量草甘膦，使盆栽基质中草甘膦含量分别为0(空白对照)、5、10、15和20 mg/kg。以塑料盆(直径18 cm × 高18 cm)为种植容器，每盆装4 kg盆栽基质，选择苗龄25 d、具备5～6片叶、高10 cm左右、长势一致的枳幼苗种于盆中，每盆一株，每个草甘膦处理20盆，放置于通风透光的塑料大棚中培养。每隔3 d左右浇一次水，浇水量以盆底无多余水分流出为限。盆栽时间为2020年4月1日至7月30日。

1.2.2 枳苗生长指标测定 2020年7月30日，从每个处理选取10株无明显病虫害和损伤的枳苗用于指标测定。使用直尺测定枳苗株高(从根颈到茎尖)和主根长(从根颈到根尖)，使用游标卡尺测定茎粗(根颈上方2 cm处)，使用Expression 10000XL根系扫描仪(Epson，日本)测定总根长、总表面积、总根尖数。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[16]测定。叶干质量测定方法：从每株幼苗中部摘取3片大小相近的叶片，每个处理10株苗共摘取30片叶，每10片叶的总干质量作为一次重复。随后去除所有叶片，将幼苗从根颈处剪断即分为茎和根。将叶、茎和根在105 ℃烘箱中干燥20 min，然后在80 ℃烘干48 h至恒重，用于干质量的测定。

1.2.3 根际土壤收集与分析 每个处理的根际土壤也取自以上选择的10株枳苗。从盆土中小心取出枳苗，将根系上的大块土壤(基质)去除，然后用细毛刷将依附在根系表面的细土轻轻刷下收集，用于后续的根际土壤有机酸含量、土壤酶活性以及土壤细菌和真菌生物量测定。

根际土壤有机酸含量测定参照罗燕等[17]的方法。称取10 g根际土，加入100 mL超纯水，摇匀后过滤，滤液先通过阳离子交换树脂柱，再通过阴离子交换树脂柱，随后用1 mol/L的盐酸洗脱阴离子交换柱内的有机酸组分，蒸干，超纯水定容至10 mL，过0.45 μm滤膜后作为待测液，利用高效液相色谱仪测定有机酸的种类和含量。同时配置草酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、丙二酸、苯甲酸、奎宁酸和柠檬酸的标准液用于绘制标准曲线。

根际土壤酶活性测定参照罗燕等[17]的方法。过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定，以0.1 mol/L的高锰酸钾与1 g土反应所用的体积(mL)表示。脲酶活性用苯酚-次氯酸钠比色法测定，以1 g土在24 h内释放的NH3-N的质量(mg)表示。转化酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以1 g土在24 h内释放的葡萄糖的质量(mg)表示。酸性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定，以1 g土在24 h内释放酚的质量(mg)表示。

根际土壤细菌和真菌的生物量分别用胞壁酸和氨基葡萄糖含量来表示。胞壁酸主要来源于细菌的细胞壁，氨基葡萄糖则存在于细菌和真菌中。细菌中胞壁酸和氨基葡萄糖的含量比例为1∶2，因此，可以通过测定出细菌中胞壁酸含量后换算出细菌氨基葡萄糖的含量，再用总氨基葡萄糖减去细菌氨基葡萄糖即可得真菌中氨基葡萄糖含量[18]。根际土壤中胞壁酸和氨基葡萄糖含量的测定参照Zhang等[19]的方法。称取0.5 g根际土，加入6 mol/L的盐酸10 mL于105 ℃水解8 h，冷却后加入1 μg/mL的肌醇溶液100 μL混匀过滤，滤液蒸干后用蒸馏水再溶解，调pH值为6.6～6.8，离心(3 000 r/min)10 min，收集上清液再蒸干，用6 mL甲醇溶解后再次离心，上清液转移至衍生瓶中，在45 ℃下氮气吹干，加入1 mL水和100 μL N-甲基氨基葡萄糖，冰冻后进行冷冻干燥，再通过醛糖腈乙酸酯法进行氨基糖衍生。衍生物采用气相色谱法检测，色谱条件参照宁照等[20]的方法。土壤中胞壁酸和氨基葡萄糖含量的计算公式为：m =(miAx)/(AiRf)，mi为肌醇浓度，Ai为肌醇的峰面积，Ax为样品中胞壁酸或氨基葡萄糖的峰面积，Rf为胞壁酸或氨基葡萄糖的相对校正因子，利用标准样品的校正因子来计算。

1.3 数据分析

使用SAS 8.1软件的Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 草甘膦对枳苗地上部分生长的影响

土壤(盆栽基质)中草甘膦含量不同，枳苗地上部分生长效果不同。土壤中草甘膦含量≤10 mg/kg时，对枳苗株高、茎粗、叶干质量和茎干质量没有显著影响；≥15 mg/kg时，使枳苗株高、叶干质量和茎干质量降低显著，20 mg/kg草甘膦处理还使茎粗显著减小(见表1)。

表1 土壤(盆栽基质)中草甘膦含量对枳幼苗地上部分生长的影响

2.2 草甘膦对枳苗根系生长的影响

土壤中草甘膦含量不同，枳苗根系生长情况也有所不同。5 mg/kg草甘膦处理对枳苗根系生长无影响；10 mg/kg草甘膦处理对枳苗根系生长影响较小，仅根系总表面积有所减小。较高浓度(≥15 mg/kg)的草甘膦处理则会明显抑制枳苗根系的生长，且抑制效果随着浓度的增加而增强(见表2)。

表2 土壤(盆栽基质)中草甘膦含量对枳幼苗根系生长的影响

2.3 草甘膦对根际土壤有机酸含量的影响

枳根际土壤有机酸的主要种类为草酸、琥珀酸、丙二酸和柠檬酸，其中以草酸的含量最多，所占比例达90%左右；柠檬酸含量最少，所占比例不超过1%。不同剂量草甘膦处理对枳根际土壤中各类有机酸含量的影响有所不同。根际土壤中草酸与琥珀酸含量在5 mg/kg的草甘膦处理中会有所增加，而后随着草甘膦剂量增加，草酸与琥珀酸含量会逐渐下降，在20 mg/kg的草甘膦条件下，草酸与琥珀酸含量与清水处理组相比分别减少了31%和47%。根际土壤中丙二酸和柠檬酸受草甘膦的影响较大，随着草甘膦处理剂量增加，丙二酸和柠檬酸含量会逐渐下降；在20 mg/kg的草甘膦处理中，丙二酸已经检测不到，而柠檬酸也只有微量存在(见表3)。

表3 土壤(盆栽基质)中草甘膦含量对枳根际土壤有机酸含量的影响 mg/kg

2.4 草甘膦对根际土壤酶活性的影响

不同剂量草甘膦处理对枳根际土壤酶活性的影响也有所不同。枳根际土壤中过氧化氢酶和转化酶活性在5 和10 mg/kg的草甘膦处理中没有发生明显的变化，而后随着草甘膦剂量继续增加，过氧化氢酶和转化酶活性会逐渐下降，在20 mg/kg草甘膦处理中，过氧化氢酶和转化酶活性与清水处理组相比分别下降了35%和65%。根际土壤中的脲酶和酸性磷酸酶活性除了在5 mg/kg的草甘膦处理中变化不明显，在其他处理条件下均显著下降；在20 mg/kg草甘膦处理中，脲酶和酸性磷酸酶活性分别下降了60%和48%(见表4)。

表4 土壤(盆栽基质)中草甘膦含量对枳根际土壤酶活性的影响

2.5 草甘膦对根际土壤细菌和真菌的影响

草甘膦对枳根际土壤中细菌和真菌的影响差异较大。在5和10 mg/kg草甘膦处理下，枳根际土壤细菌胞壁酸含量与清水对照差异不明显，随着草甘膦浓度进一步增加，根际土壤胞壁酸含量也逐渐减少，在20 mg/kg草甘膦处理下根际土壤胞壁酸含量与清水处理相比减少了31%。根际土壤中真菌氨基葡萄糖含量则随着草甘膦浓度的增加呈现出先增后减的趋势，在20 mg/kg草甘膦处理下，氨基葡萄糖含量与清水处理相比减少了12%(见图1)。

图1 土壤(盆栽基质)中草甘膦含量对枳根际土壤细菌和真菌生物量的影响

3 讨论与结论

在本试验中，5和10 mg/kg草甘膦处理对枳苗地上部和地下部的生长没有明显影响，这与陈贵虎等[21]和梁敬崎等[22]利用较低剂量草甘膦处理枳和红桔幼苗的试验结果相同。少量的草甘膦进入土壤后，可以很快与铝和铁等金属离子结合，从而失去活性，并且也会被土壤微生物降解为水、磷酸和二氧化碳[5-6]，因而对枳幼苗根系产生的毒害作用不明显。然而，较高量的草甘膦进入土壤，则无法在短时间内全部与金属离子结合或者被微生物降解，残存的草甘膦可以被植物根系吸收，再经过植物输导组织运输到植株地上部分[23]。草甘膦在植物体内会通过抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性致使莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化受阻，进而导致蛋白质合成受到干扰[24-25]。草甘膦进入叶片细胞后，还会抑制类胡萝卜素、叶绿素合成以及光合作用相关酶的活性，阻碍光合产物的积累[26-27]。因此，在较高量草甘膦胁迫下，枳幼苗的地上部分生长受到了明显的抑制作用。植物根系是最先接触土壤中草甘膦的器官，草甘膦被根系吸收后会在根尖部分大量富集，并络合细胞中的金属阳离子，从而造成根系细胞受损，影响根系生长[26]，较高量的草甘膦还会减少枳幼苗根系生物量，并抑制根系长度增长，这与宋宏峰等[28]在毛桃上的研究结果相似。

土壤酶主要来源于土壤中动植物和微生物的分泌物以及残体的分解物，是植物营养元素的活性库，土壤酶活性改变将会影响土壤中碳、氮、磷等元素的循环过程[32-33]。在本试验中，高量草甘膦处理的枳根际土壤过氧化氢酶、脲酶、转化酶和酸性磷酸酶活性均显著降低。这可能是由于高量的草甘膦抑制了枳幼苗根系以及土壤微生物的生长，最终导致来源于植物根系和土壤微生物的土壤酶也相应减少。

土壤微生物与土壤腐殖质形成、有机物分解、养分转化与循环等过程密切相关，是土壤质量的重要影响因子[34]。在本试验中，根际土壤真菌氨基葡萄糖含量会随着草甘膦剂量的增加而呈现出先增后减的趋势，这与根际土壤中草酸含量的变化趋势相似。植物根系分泌的有机酸可以作为营养物质被根际土壤真菌利用，有机酸在根际土壤中积累而形成的酸性环境也更有利于真菌的生长，因此根际土壤真菌数量与植物根系分泌物通常会呈现出正相关[35]。而高量的草甘膦处理不仅减少了根系有机酸的分泌，也可能会抑制根际真菌的生长[5]。根际土壤中细菌胞壁酸含量则随着草甘膦剂量增大而减少，并不会出现增加的情况，可能是因为根际土壤真菌与细菌之间会存在竞争关系。

综上可知，高量草甘膦存在于土壤中会显著抑制枳幼苗地上部和地下部的生长，并降低根际土壤有机酸含量、土壤酶活性以及细菌和真菌的生物量，使根际土壤环境逐渐向不利于枳幼苗生长的方向发展。