基于网络药理学探讨安化黑茶延缓动脉粥样硬化的分子机制研究

王华，刘柏炎，陈博威，汤艳

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；

3.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 413000）

关键字：安化黑茶；动脉粥样硬化；网络药理学；分子机制

随着经济快速发展，人们的生活方式以及饮食结构也随之改变，导致动脉粥样硬化的发病率呈持续上升趋势[1]。动脉粥样硬化的发生发展较隐匿，病变的早期没有临床症状且难以检测。因此，寻找一种药食同源的食物防微杜渐，从源头上延缓动脉粥样硬化显得十分重要。安化黑茶作为一种健康饮料，主要来源植物为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）茶组植物[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze][2,3]，具有良好的保健功效。课题组前期研究发现，安化黑茶可通过降血脂，抑制氧化应激，发挥延缓动脉粥样硬化的作用[4,5]。然而以往的研究都是针对单一靶点及单一通路，无法系统阐明安化黑茶延缓动脉粥样硬化的分子机制。网络药理学整合了系统生物学的思想，通过对“药物 靶点网络

疾病”之间的网络分析，广泛地应用于天然产物药效物质基础的筛选及其作用机制的研究中[6]。因此基于前期认识，本研究拟通过网络药理学方法，系统探究安化黑茶延缓动脉粥样硬化的药效物质基础及相应的分子机制，并进行初步实验验证，以期为其新药开发和基础研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 安化黑茶中活性成分筛选与作用靶点预测

本研究通过中国知网（https://www.cnki.net）及Pub-Med数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）检索安化黑茶活性成分[3,7,8]。随后将各活性成分导入至中药系统药理学数据库（TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php）及STITCH数据库（http://stitch.embl.de/），查询其潜在作用靶点，最后将靶点导入Uniprot数据库（http://www.uniprot.org），限定物种为“human”，获取靶点官方基因名。

1.2 动脉粥样硬化相关靶点的获取

本研究以“atherosclerosis”为关键词，分别检索人类基因数据库（Gene Cards,https://www.genecards.org）和比较毒物基因组学数据库（CTD,http://ctdbase.org），合并且删除重复靶点后，构建疾病靶标库。

1.3 活性成分 靶点网络及蛋白互作网络的构建

通过jvenn在线工具，将安化黑茶的预测靶点与动脉粥样硬化的预测靶点取交集，获取疾病 药物关键作用基因。运用Cytoscape 3.71软件创建活性成分靶点网络图，并借助String数据库，将物种设定为“homo sapiens”，最低互作得分设置为0.7，得到蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络图。

1.4 核心作用基因的富集分析

运用R语言“Biomanager”、“ClusterProfiler”等软件包，将得到的靶点基因进行基因本体（gene ontology,GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。

1.5 成分 靶点 通路网络图的构建

将主要KEGG通路富集结果与活性成分-靶点网络图进行汇总，运用Cytoscape 3.71软件构建成分-靶点-通路网络图。

1.6 动物实验验证

1.6.1 实验动物 60只雄性SD大鼠，SPF级，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。于湖南中医药大学实验动物中心饲养，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009，实验过程中对大鼠的处置均符合湖南中医药大学伦理委员会善待动物的伦理学要求。

1.6.2 主要药品与试剂 安化黑茶品种为2014年天茯茶[9]（生产批号：GB/T9833.3-2002，规格：1 kg）、阿托伐他汀钙胶囊（河南天方药业，批号：H20070054，规格：20 mg）、Rat IL-6 ELISA Kit（武汉博士德公司，EK0412）、Rat TNF alpha ELISAKit（武汉博士德公司，EK0526）。安化黑茶水煎剂制备方法[9]：将安化黑茶按每克茶叶加12 mL沸水，武火煮至沸腾后改文火，继续煎煮20 min，冷却后倒出茶水另置。第2次加水量为每克茶叶加8 mL沸水，煎煮同前。将2次茶水混合并4 000 r/min（4℃）离心15 min后，取上清液浓缩为含生药量为0.5 mg/mL的药液，其后放置在4℃冰箱中，冷藏备用。

1.6.3 造模与分组 大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组10只、造模组50只。正常组给予普通饲料，造模组给予自制高脂饲料（按参考文献[10]配制），自由饮食饮水，连续喂养12周。同时，造模各组在造模前先腹腔注射VitD3 60万IU/kg，造模后的第3周、第6周和第9周各自补充VitD310万IU/kg，建立动脉粥样硬化大鼠模型。喂养12周后，根据大鼠体质量及血清血脂水平验证模型是否建立成功，随后将造模成功的模型大鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组和黑茶高、中、低剂量组，每组10只。

1.6.4 给药方法 阿托伐他汀组每日给药量为10 mg/kg，各安化黑茶组根据成人每天推荐饮用量10 g[11]，按照成人体质量60 kg换算，安化黑茶高、中、低剂量组每日给黑茶（生药）量分别为2.03 mg/kg、1.015 mg/kg、0.507 5 mg/kg，正常组、模型组给同等体积蒸馏水灌胃。每天灌胃1次，连续4周。处死大鼠前禁食12 h，水合氯醛麻醉后进行腹主动脉采血并收集主动脉组织。

1.6.5 HE染色 将浸泡在4%多聚甲醛中的心底及主动脉组织取出，脱水，透明并包埋。切片，厚度约为4m，将切片充分舒展后晾干，烤片，随后依次通过二甲苯及各浓度酒精中，接着放入苏木素中染色后用自来水充分冲洗，酸化，然后用伊红染色，最后进行透明及封片。

1.6.6 大鼠血清中白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-,TNF-）含量的测定腹主动脉采血后静置2 h，将血液在12 000 r/min（4℃）离心15 min，使用移液枪小心吸取上层血清，采用酶联免疫分析法进行测定，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法

计量资料均以平均数±标准差（x±s）进行统计，采用单因素方差分析的统计学方法来比较多组间均数，针对组间两两比较方差齐者的数据进行LSD检验（方差不齐者先将数据转换后使之方差齐），P＜0.05说明差异有统计学意义。运用Graphpad Prism 8作图软件分析并处理。

2 结果

2.1 安化黑茶活性成分筛选与作用靶标预测

通过检索中国知网及PubMed数据库，共计获得30个活性成分，详见表1。其后通过TCMSP数据库与STITCH数据库，获得预测作用靶点296个。

表1 安化黑茶中活性成分表Table 1 List of active ingredients in Anhua dark tea

2.2 安化黑茶防治动脉粥样硬化靶点的获取

分别筛选Genecards数据库和CTD数据库与疾病相关的靶点，其中Genecards数据库获取靶点2 371个，CTD数据库获取靶点14 899个。运用jvenn在线工具将两数据库疾病靶点与黑茶靶点进行交集，并通过Venn图可视化，发现三者共有靶点有175个，涉及29个活性成分，详见图1。

图1 安化黑茶与疾病的韦恩图Fig.1 Venn diagram of Anhua dark tea and diseases

2.3 活性成分 靶点网络及PPI网络分析

将安化黑茶延缓动脉粥样硬化的29个活性成分和175个关键作用基因导入Cytoscape软件，构建活性成分 靶点网络图，其中活性成分依据节点度排名依次为槲皮素、(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯、山柰酚、杨梅素、大黄素及(-)-表儿茶素，详见表2及图2。借助String数据库，输入上述已获得的关键作用基因，获得了一个包含175个节点，3 824条边的蛋白互作网络图，见图3 A，另外排名前10的核心作用基因依次为INS、AKT1、ALB、IL6、MAPK3、VEGFA、EGF、CASP3、EGFR及JUN，详见图3 B。

图3 PPI网络及核心基因节点度排名Fig.3 Protein-protein interactions network and core gene ranking

表2 主要活性成分的节点度排名Table 2 Node ranking of major active ingredients

图2 活性成分 靶点网络图Fig.2 The diagram of active ingredient-target network

2.4 核心作用基因的富集分析

将安化黑茶作用靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析。其中共获得GO功能富集分析2 572个，包括生物过程2 328个，细胞组成69个，分子功能175个。主要的生物过程为对营养水平、氧化应激和脂多糖的反应；主要的细胞组成为膜筏、膜微区及囊泡腔等，主要的分子功能为DNA结合转录激活因子活性、DNA结合转录因子结合及信号受体激活剂活性等，详见图4 A、4 B和4 C。共获得622个KEGG通路富集结果，结果表明流体剪切应力和动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物 糖基化终末产物受体（advanced glycosylation end products-receptor of AGEs,AGEs-RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路、白介素-17（IL-17）信号通路及缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）信号通路可能在疾病的过程中发挥重要作用，详见图4 D。

图4 GO功能和KEGG通路富集分析Fig.4 GO function analysis and KEGG enrichment analysis

2.5 活性成分 靶点 通路网络图的构建

将KEGG富集分析排名前10的主要结果与2.3得出的活性成分-靶点网络进行汇总，得到成分 靶点通路网络图，其中节点度值靠前的活性成分依次为槲皮素、(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯、山柰酚及杨梅素，节点度值靠前的基因依次为PTGS2、RELA、CASP3、HSP90AA1、AKT1及IL6，提示安化黑茶能够通过多种活性成分、多个靶点及多条通路协同延缓动脉粥样硬化。

图5 活性成分 靶点 通路网络图Fig.5 The network of active components-targets-pathways

2.6 动物实验验证

2.6.1 HE染色 如图6所示，正常组可见动脉管壁光滑，内皮细胞排列连续、规则；模型组可见动脉管壁内膜明显增厚，内皮细胞缺失，排列不整齐，夹杂泡沫细胞；阿托伐他汀组及安化黑茶各剂量组相对正常组而言，内皮细胞排列不齐，动脉管壁内膜稍增厚，但相对模型组而言，内皮细胞排列较整齐，泡沫细胞相对减少，动脉管壁内膜厚度降低，提示安化黑茶能够延缓动脉粥样硬化的形成。

图6 主动脉组织病理学检查（HE100）Fig.6 Histopathological examination of aorta(HE100 )

2.6.2 安化黑茶对动脉粥样硬化大鼠血清IL-6和TNF-含量的影响 上述网络药理学结果表明抑制炎症反应可能是安化黑茶的作用机制，本研究进一步验证了安化黑茶对动脉粥样硬化大鼠血清相关炎症因子的影响。如图7所示，模型组大鼠血清中的IL-6和TNF-含量较正常组模型升高（P＜0.01），另外阿托伐他汀组及安化黑茶各剂量组大鼠血清中的IL-6和TNF-含量较模型组降低（P＜0.01或0.05），提示安化黑茶能降低动脉粥样硬化大鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-的表达水平。

图7 安化黑茶对动脉粥样硬化大鼠血清IL-6和TNF-a水平的影响Fig.7 Effects of Anhua dark tea on serum IL-6 and TNF-a levels in atherosclerotic rats

3 讨论

动脉粥样硬化的发病机制尚不明确，主要考虑与脂质代谢异常、慢性炎症反应、血管内皮细胞损伤及氧化应激等有关[1]。目前，防治动脉粥样硬化的方案常以口服他汀类药物为主，但是随着治疗时间的延长，长期服用此类药物会出现肝肾脏损伤等不同程度的副作用，严重降低患者在治疗过程中的依从性。既往研究表明，饮用安化黑茶具有消食去肥腻、抗氧化及改善肠道菌群等功效[12]，然而安化黑茶作为一种水煎剂，药效物质基础复杂，仅靠以往的研究方法很难系统、全面地阐明其作用机制。

本研究发现安化黑茶中槲皮素、(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯、山柰酚、杨梅素及大黄素可能是延缓动脉粥样硬化的主要活性成分。相关文献亦证实了上述活性成分的作用：如槲皮素既能通过调控蛋白激酶B（Protein Kinase B,AKT1）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase 3,CASP3）的表达，抑制动脉粥样硬化[13]，亦能通过抑制IL-6和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）的水平，发挥消退动脉粥样斑块的作用[14]；表儿茶素能够通过降低C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）及核因子B（nuclear factor kappa-B,NF-B）的表达，改善血管内皮功能，减轻动脉粥样硬化[15]；山柰酚能够降低TNF-、IL-1及血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）的表达，延缓动脉粥样硬化的形成[16]；杨梅素能通过抑制胆固醇蓄积，降低动脉粥样硬化小鼠的体重及血脂水平[17]。此外亦有研究报导大黄素能够抑制氧化应激，阻断单核细胞迁移[18]，发挥抗动脉粥样硬化的作用。

通过String数据库构建的PPI网络及活性成分靶点 通路网络，本研究发现INS、AKT1、ALB、IL6、MAPK3、VEGFA、EGF、CASP3、EGFR、JUN、PTGS2及RELA可能是靶点蛋白相互作用的核心集群。查阅文献后发现这些核心靶点主要与炎症反应、细胞增殖及凋亡密切相关。如AKT1可通过参与多个与炎症反应、细胞周期等相关的通路如AGE-RAGE信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路，对相关生物学过程进行调节。MAPK3和JUN属于MAPK家族，可通过三级激酶模式共同调节炎症反应细胞的生长、分化及应激适应等多种生理病理过程[19]。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）可在细胞膜上与其受体VEGFR结合，通过促进血管内皮细胞增殖、迁移和抑制凋亡起到促进血管生成的作用[20]。表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体具有阻断CD4细胞的增殖，减少动脉粥样硬化发生的作用[21]。CASP3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，广泛参与了心脑血管疾病的发展过程。PTGS2（COX-2）是一种重要的炎症递质，可诱导巨噬细胞产生IL-6等各类炎症因子[22]。RELA又名NFKB1，NF-B是调节炎症和各种自身免疫性疾病的关键转录因子，众多促炎细胞因子包括TNF-、IL-1、iNOS及COX-2均可通过NF-B的激活而释放[23]。

通过对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，本研究发现流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGERAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路可能在延缓疾病的过程中发挥重要作用。剪切应力是指血液流动时与血管壁面摩擦产生的切向应力，研究表明较低的切应力区域有产生动脉粥样硬化的可能[24]，并且会诱导内皮细胞转分化为间充质细胞，参与动脉粥样硬化的形成过程，加大心脑血管疾病的发生风险。AGE-RAGE信号通路不仅能引起糖脂代谢紊乱、增强氧化应激，还能激活PI3K-Akt信号通路及MAPK信号通路促进炎症反应，加重动脉粥样硬化[25]。TNF信号通路是介导各种炎症反应的关键通路,研究表明TNF-会导致血管内皮细胞大片脱落和形态改变，表明TNF-对血管内皮细胞具有直接的细胞毒作用，而抑制TNF-的表达能够减轻细胞炎症，延缓动脉粥样硬化[26]。其他研究亦表明动脉粥样硬化还与其他KEGG富集结果如IL-17信号通路和HIF-1信号通路密切相关。HIF-1是各种低氧诱导基因调控的关键转录因子，当组织缺血缺氧以及在多种炎症因子的诱发下，HIF-1会被诱导激活，刺激血管新生，促进斑块的发展和重塑[27]。由此可见，安化黑茶延缓动脉粥样硬化的机制可能与调控炎症反应、氧化应激及血管生成等病理生理反应密切相关。

上述网络药理学结果表明抑制炎症反应可能是安化黑茶延缓动脉粥样硬化的重要机制，因此本研究进一步通过动物实验验证安化黑茶对动脉粥样硬化大鼠主动脉及血清中炎症因子IL-6和TNF-含量水平的影响。IL-6是一种上游炎性细胞因子，在引发AS的炎症反应中起核心作用。最近的临床观察发现，血清中IL-6的含量水平与动脉粥样硬化的发病率呈正相关[28]，抑制IL-6的表达后能够显著延缓大鼠动脉粥样硬化的形成[29]，提示其可能是防治动脉粥样硬化的潜在靶点。TNF-同样作为前炎症因子，亦为公认的促动脉粥样硬化因素[30]，且TNF-可在血管内皮沉积，损伤血管内皮。动物实验结果证实安化黑茶能够延缓动脉粥样硬化的形成，并降低动脉粥样硬化大鼠血清中的炎症因子IL-6和TNF-含量水平，与网络药理学预测结果一致，增强了本研究的可靠性。

综上所述，本研究初步探讨了安化黑茶延缓动脉粥样硬化的潜在活性成分和分子机制，发现安化黑茶中29个活性成分及175个预测靶点与动脉粥样硬化相关，这些靶点主要与炎症反应、氧化应激及血管生成等病理生理反应关系密切，并进行了初步实验验证，可为今后的药物开发和基础实验提供依据。