越冬期长白山中华蜜蜂与意大利蜜蜂保护酶系活性及耐寒生理指标的测定

刘楠楠，李杰銮，常志光

（吉林省养蜂科学研究所，吉林 吉林 132108）

长白山脉是欧亚大陆东缘的最高山系，拥有东北亚温带地区谱系最多的山地垂直带系统，是我国东北地区最重要的生态屏障[1]，动植物资源独特而丰富。长白山中华蜜蜂（Apis cerana cerana，以下简称长白山中蜂）是其分布区内的自然蜂种，它是在长白山生态条件下，经过长期自然选择而形成的中华蜜蜂的一个类型[2]，广义的长白山中蜂尚包括分布于朝鲜半岛乃至俄罗斯远东海冰边疆地区的东方蜜蜂生态型[3]。种群在长白山脉长期栖息，形成了明显的长白山区适应特征，特别是耐寒性较强，在﹣40℃的酷寒条件下，依然能够自然越冬。在栖息地的丧失和碎片化以及西方蜜蜂长期干扰东方蜜蜂生殖行为等威胁因素的持续作用下，长白山中蜂数量明显减少[4-6]，目前的种群数量已不足1万群，处于濒危-维持状态[2]，遗传资源的保护、评价和利用工作迫在眉睫。

昆虫的抗寒生理机制极为复杂，是昆虫长期进化过程中形成的一系列的低温适应对策。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）合称昆虫的保护酶系统[7]，能相互协作调控清除机体内活性氧，使自由基浓度维持在正常水平，构成有机体相互保护的防御系统，可作为昆虫生理状态改变的度量指标[8,9]。有研究表明抗氧化能力降低是蜜蜂寿命缩短和行为衰老的主要原因[10]，当蜜蜂个体处于低温逆境条件时，昆虫保护酶系统会对机体的氧化应激做出一系列的防御反应，诱发机体的生理代谢活动发生改变[11]；另一方面，根据越冬昆虫体内是否存在冰晶，其越冬对策可分为避冻和耐冻两种策略[12]，它们共同的越冬机制是小分子量糖醇物质的积累，目前已知的抗寒性物质有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇、海藻糖、葡萄糖、果糖以及氨基酸和脂肪酸类等[13]，某些昆虫还可以同时运用两种策略，必要时在这两种策略间进行转换[14]。大多数越冬昆虫中会由几种抗寒物质共同构成一个抗冻保护物质系统[15,16]，蜜蜂的越冬能力很大程度上取决于其抗寒性[17]，通过减少体内自由水含量、积累抗寒物质等生理状态的改变来增强其耐寒能力[18]，有研究认为其体内可能存在“葡萄糖 甘油 氨基酸”的抗寒物质系统[19]。

本试验选取越冬时期最冷时段（当年12月至翌年2月）长白山中蜂和意大利蜜蜂种群的SOD、CAT和POD活性及总氨基酸（T-AA）、糖原（Glycogen）、葡萄糖（Glucose）和甘油（Glycerol）的含量进行测定，以非耐寒蜂种的意大利蜜蜂为对照，从保护酶系活性以及耐寒生理指标两个方面明确长白山中蜂越冬耐寒的生理机制，以期为后续抗寒新品系的选育、蜂群安全越冬策略以及抗寒性状的评价提供基础数据。

1 材料

1.1 试验蜂群

试验于2019年12月至2020年2月，在吉林省养蜂科学研究所试验蜂场进行（吉林省吉林市）。所用中华蜜蜂蜂群为纯种长白山中蜂，由吉林省养蜂科学研究所国家级中蜂（长白山中蜂）保护区提供；所用意大利蜜蜂蜂群为松丹2号，由吉林省养蜂科学研究所蜜蜂遗传资源基因保护中心提供。选取活框饲养的健康无病、无自然分蜂的长白山中蜂和意大利蜜蜂各3群作为试验蜂群，在越冬前补喂越冬饲料，各蜂种保持群势相当，于自然条件下室外越冬。

1.2 样品采集

在蜂群越冬前标记两个蜂种新出房的工蜂，选取蜜蜂越冬期的最冷时段，即当年的12月至翌年的2月，吉林地区户外的最高和最低温度均为零摄氏度以下。每间隔15 d（当月的10日和25日）进行一次样品采集，置于﹣80℃超低温冰箱内保存，备用。

1.3 主要试剂和仪器

超氧化物歧化酶试剂盒、过氧化氢酶试剂盒、过氧化物酶试剂盒，以及总氨基酸、糖原（Glycogen）、葡萄糖和甘油含量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

Ultrospec 7000紫外可见分光光度计（英国柏楉有限公司）；Thermo Scientific Sorvall Stratos低温高速离心机。

2 方法

2.1 保护酶系的酶活性测定

严格按照试剂盒说明书操作，根据公式计算得出越冬时期每个时段样品体内的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活力值。测定时每组样品做3个平行处理，所有待测样本为同一批次。

2.2 耐寒生理指标的测定

严格按照总氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量的试剂盒说明书操作，根据公式计算得出越冬时期每个时段样品体内的总氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油的含量值。测定时每组样品做3个平行处理，所有待测样本为同一批次。

2.3 数据处理与分析

将获得的实验数据应用SPSS 19.0软件统计处理，采用数据分析中的one-way ANOVA进行单因素方差分析（P＜0.05表示差异显著），随后采用Tukey's HSD进行多重检验；应用GraphPad Prism 8.0软件进行图表制作。

3 结果与分析

3.1 越冬期体内保护酶系活性变化分析

3.1.1 超氧化物歧化酶活性 在越冬期的每个最冷时间段，长白山中蜂的SOD活性对比意大利蜜蜂均明显较高，且两个蜂种的各时间点酶活力值差异显著（P＜0.05），见图1。

图1 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的SOD活性变化Fig.1 The change of SOD activity ofduring the overwintering period

3.1.2 过氧化氢酶活性 在越冬期的最冷时间段，两个蜂种的CAT活性变化趋势基本一致，长白山中蜂在每个时段的CAT活性均明显高于意大利蜂，且两个蜂种的各时间点酶活力值差异显著（P＜0.05），见图2。

图2 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的CAT活性变化Fig.2 The change of CAT activity ofandduring the overwintering period

3.1.3 POD活性 在越冬期的最冷时间段，除2020年1月10日和2020年2月10日的2个时间点，长白山中蜂的POD活性均高于意大利蜜蜂，且两个蜂种的各时间点酶活力值差异显著（P＜0.05），见图3。

图3 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的POD活性变化Fig.3 The change of POD activityduring the overwintering period

3.2 越冬期体内生理指标变化分析

3.2.1 总氨基酸含量 长白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各个最冷时段体内的总氨基酸含量差异显著，且两蜂种间存在差异（P＜0.05）。通过比较两蜂种在同一时间点的总氨基酸含量可发现，长白山中蜂体内的总氨基酸含量在每个时间点均显著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），见图4。

图4 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的T-AA含量变化Fig.4 The change of total amino acid content of during the overwintering period

3.2.2 糖原含量 长白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各个最冷时段体内的糖原含量差异显著，且两蜂种间存在差异（P＜0.05）。通过比较两蜂种在同一时间点的糖原含量可发现，长白山中蜂体内糖原的含量在每个时间点均显著低于意大利蜜蜂（P＜0.05），见图5。

图5 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的糖原含量变化Fig.5 The change of the glycogen content ofduring the overwintering period

3.2.3 葡萄糖含量 长白山中蜂在越冬期的各个最冷时段体内的葡萄糖含量存在显著的起伏变化（P＜0.05），意大利蜜蜂则总体呈下降趋势，且不同蜂种间存在一定差异。通过比较两蜂种在同一时间点的葡萄糖含量可发现，除12月份的两个时间段，其他时间点的长白山中蜂体内葡萄糖含量显著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），见图6。

图6 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的葡萄糖含量变化Fig.6 The change of glucose content ofandduring the overwintering period

3.2.4 甘油含量 长白山中蜂和意大利蜜蜂在越冬期的各个最冷时段体内的甘油含量存在显著的变化（P＜0.05），且不同蜂种间存在一定差异。通过比较两蜂种在同一时间点的甘油含量可发现，除2020年1月10日和2020年2月25日两个时间点，其他时段的长白山中蜂体内甘油含量显著高于意大利蜜蜂（P＜0.05），见图7。

图7 越冬期长白山中蜂和意大利蜜蜂的甘油含量变化Fig.7 The change of the glycerol content ofduring the overwintering period

4 讨论

长白山陆地生态系统呈多重景观格局，季节性寒冷是长白山区重要的限制性生态因子之一。长白山中蜂是长白山生态系统中宝贵的种质遗传资源[20]，是长期适应冬季寒冷，无霜期短等严酷生态环境具有强大适应性的特殊种群、了解它在越冬期的抗寒适应性生理机制对于种群的保护利用十分必要。

昆虫耐寒性体现出对环境适应的能力，与生态环境的季节性变化、遗传因素、营养状况和暴露低温的时间长短等因素相关，是种群能否成功越冬与翌年繁殖的重要前提[21]，机体内保护酶系的活性变化可作为昆虫抗逆能力的重要指标[22]。根据吉林地区2019年12月至2020年2月冬季气候资料（中国气象数据网：http://data.cma.cn），最高气温和最低气温均在0℃以下，为越冬蜂群经历的最冷气候阶段，自然条件下室外越冬种群的耐寒性试验结果更能代表两个蜂种真实的耐寒性水平。本研究结果表明，在越冬期最寒冷的3个月时间段内长白山中蜂体内的SOD和CAT的活性显著高于意大利蜜蜂，总体的POD活性表现也高于意大利蜜蜂，且整体的酶活力值并无明显下降，说明越冬期长白山中蜂的保护酶系统可能存在一定的抗氧化应激防御机制，在冬季低温的不利环境下协同发挥增效作用，帮助蜜蜂个体在越冬期间增强耐寒性，且整体表现优于意大利蜜蜂。与夏振宇等[23]发现中国北方越冬期的中华蜜蜂体内抗氧化系统防御能力趋强，对低温胁迫存在耐寒响应生理机制的研究结果一致。

越冬昆虫要经历漫长的越冬期，不仅需要消耗一定的能量物质来维持正常代谢，同时需要自身一系列生理生化反应以应对低温不利环境，糖原和脂肪是越冬前重要的能量储备物质[24]，在越冬阶段或低温胁迫刺激下还会在体内大量积累低分子糖、醇类物质作为抗冻保护物质以增强昆虫耐寒性[25-27]，这些化合物具有避免昆虫结冰、融化和提高长时间冷暴露条件下的存活率的作用，能够客观反映昆虫的耐寒性生理响应机制，它们可作为越冬昆虫的耐寒性指标[28]。本研究的结果表明，长白山中蜂在越冬期最冷时段体内的总氨基酸、糖原、葡萄糖和甘油含量有明显的波动变化，说明面对外界低温存在一定的生理应答机制，蜜蜂个体抵御冬季低温不仅是单一物质积累而是多元抗冻保护物质互相协调共同作用的复杂过程，其中总氨基酸、葡萄糖和甘油的含量总体上要显著高于意大利蜜蜂，它们可能是长白山中蜂越冬期关键的抗冻保护物质。Xu等[19]对20日龄的中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂进行0℃、10℃和25℃持续4 h的温度处理发现，在低温胁迫下中华蜜蜂通过转化氨基酸为能量来抵御寒冷，有17种氨基酸参与机体的抗寒机制，而意大利蜜蜂只有15种。糖类物质和甘油是昆虫的主要抗寒保护剂，诱导产生的耐寒性小分子化合物，与结合水结合增加体液浓度从而降低过冷却点，也可以与酶等物质相互作用来保护昆虫[29]，且它们存在相互转换的关系，二化螟越冬幼虫体内的葡萄糖和糖原在越冬期间会向甘油进行转化[30]。

长白山中蜂在长期适应性进化过程中通过越冬耐寒锻炼提高了对低温和亚低温的耐受性，获得了抵御冬季寒冷温度的多种耐逆性机制，包括越冬期间抗冻保护物质在其体内的生物合成、积累、代谢以及保护酶系的防御调控，以增强种群的耐寒性。本试验结果加强了对长白山中蜂种群耐寒性状的综合理解，为明确种群的抗寒能力和耐寒策略提供科学依据，其中抗氧化酶、氨基酸、葡萄糖和甘油之间在调节机体耐寒功能的分子研究需要更进一步地展开。