中性粒细胞胞外诱捕网在原发性胆汁性胆管炎患者中的作用初步探析

偶绎颜， 崔娜娜， 李 瑶， 钱其炜， 马 雄， 尤征瑞， 连 敏， 王绮夏

上海交通大学医学院附属仁济医院 消化内科， 上海市消化疾病研究所， 上海 200001

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种以渐进性肝内小叶间胆管破坏为特征的自身免疫性肝病[1]。好发于中老年女性，多数患者可出现血清ALP、GGT升高以及乏力、瘙痒等症状[2-3]。近90%～95%的患者血清抗线粒体抗体阳性[4]。人体外周血的中性粒细胞数量多、寿命短，具有向炎症部位迁移的能力。同时，还具有吞噬、脱颗粒以及新近发现的释放中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NET)功能[5]。上述特征使之成为人体固有免疫系统的重要组成部分。中性粒细胞可以在感染和无菌性炎症的条件下，通过钙动员或产生活性氧的分子机制形成NET，这种产生NET的方式是不同于凋亡和坏死的NETosis形式[6]。NET是由组蛋白和抗菌肽等修饰的DNA构成的网状结构，越来越多研究[7-9]表明NET与炎症或者自身免疫性疾病有关，包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎以及炎症性肠病等。本研究旨在探索NET与PBC之间的相关性，为临床诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年8月—2020年8月在上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科诊断为PBC的患者24例以及与PBC患者年龄相匹配的自身免疫性肝炎(AIH)患者19例、原发性硬化性胆管炎(PSC)患者8例和健康对照(HC)18例。其中，PBC的诊断符合《原发性胆汁性肝硬化(又名原发性胆汁性胆管炎)诊断和治疗共识(2015)》[10]，AIH的诊断符合国际自身免疫性肝炎学组制定的AIH简化诊断积分系统[11]，PSC的诊断符合《原发性硬化性胆管炎诊断和治疗专家共识(2015)》[12]。

1.2 临床资料 收集PBC、AIH、PSC患者和HC组的人口学基本资料。此外，PBC患者进一步收集病史资料以及实验室检查指标，包括肝生化指标、自身免疫相关抗体和血清免疫球蛋白等。后续对PBC患者的上述实验室指标与NETosis标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平进行相关性分析。

1.3 实验方法

1.3.1 分离中性粒细胞 采用EDTA抗凝管抽取PBC患者和HC组全血2 mL，利用密度梯度离心法提取中性粒细胞。向15 mL离心管中顺次加入人中性粒细胞分离液Histopaque-1119、Histopaque-1077(美国Sigma公司)和全血，1850 r/min离心30 min，对中性粒细胞进行分离。吸取第二层悬浮细胞，然后用裂红液(美国Sigma公司)进行裂红，用RPRI1640洗涤、重悬。显微镜下计数、流式检测中性粒细胞的纯度及活率[13]。

1.3.2 检测NET形成水平 从PBC患者和HC组外周血中按上述方法分离出中性粒细胞后，以约2×104个细胞分别加入48孔培养板中，每孔加入200 μL细胞悬液，以终浓度100 ng/mL的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)加入阳性对照组[14-15]。同时，在阳性对照组及空白组加入终浓度250 nmol/L的Sytox green(美国Invitrogen公司)。37 ℃恒温条件下孵育4 h，用荧光显微镜进行观察。

1.3.3 检测血清对NET生成的影响 分离HC组外周血中性粒细胞，约2×104个细胞加入48孔培养板，分为两组：一组加入10%的HC血清，另一组加入PBC患者血清，两组皆加入终浓度250 nmol/L的Sytox green，在37 ℃进行孵育[16]，4 h后进行观察。

1.3.4 ELISA法检测血清中MPO水平 收集PBC、AIH、PSC患者和HC组的血清，保存在-80 ℃冰箱。实验前将血清恢复至室温，混匀并离心，取上层清液，采用ELISA法(MPO检测试剂盒，货号SEA601Hu，武汉云克隆公司)测定MPO水平。

1.3.5 肝组织免疫荧光检测 收集PBC患者和HC组肝组织冰冻样本各5例(HC的肝组织来源于本院行肝血管瘤切除术时的正常肝组织)，制成切片后依次用甲酸通透、PBS洗涤、驴血清封闭，然后滴加一抗(抗MPO抗体：货号AF3667，美国R&D Systems公司；抗组蛋白H3抗体：货号ab5103, 美国Abcam公司)，4 ℃湿盒过夜。次日复温1 h后，PBS洗涤，滴加与一抗结合的二抗，室温孵育30 min。PBS洗涤，滴加DAPI染细胞核，盖上盖玻片。制片完成后在荧光共聚焦显微镜下进行观察。

2 结果

2.1 PBC患者外周血NETosis的标志物升高 各组年龄分别为(44.67±13.51)岁、(45.63±11.64)岁、(40.63±14.00)和(47.33±9.00)岁。HC、AIH和PBC组患者均为女性；PSC组中女性4例，男性4例。PBC组血清中的MPO水平[811.21(450.67～1 216.20)ng/mL]较AIH组[468.58(142.63～812.43)ng/mL]和HC组[357.54(203.52～811.21)ng/mL]明显升高(P值均<0.05);提示在PBC患者外周血中，NET的产生量显著增加。PSC患者血清中MPO水平[763.56(489.59～1 633.14)ng/mL]也较HC组显著升高(P<0.05)(图1a)。进一步分析PBC相关抗体表达与MPO水平的相关性，结果显示均无显著性差异(P值均>0.05)(图1b～f)。

2.2 NET的含量与肝脏生化指标的相关性 结果表明，随着外周血NET水平的升高，ALP、GGT、AST、ALT皆呈现上升趋势，其他指标则不存在显著相关性，提示GGT、ALP、AST、ALT水平的升高与NET水平在疾病状态下升高存在正相关(P值均<0.05)(表1，图2)。

2.3 PBC患者肝组织内存在NET NET在人体组织内的表达可以由MPO和瓜氨酸组蛋白H3(cit histone H3, H3Cit)共定位来明确[17]。通过免疫荧光共聚焦方法观察到PBC患者的肝组织中存在MPO和H3Cit的共定位，而在HC组的肝组织中则没有观察到二者的共定位(图3)。

表1 PBC患者肝脏生化指标基本资料Table 1 Basic information of liver biochemical indicatorsin PBC patients

注:a，4组血清中MPO水平；b，PBC患者血清线粒体抗体(AMA)阳性或阴性者MPO水平；c，PBC患者血清抗2-丙酮酸脱氢酶(M2-3E)抗体阳性或阴性者MPO水平；d，PBC患者血清抗线粒体-M2型抗体(M2)阳性或阴性者MPO水平；e，PBC患者血清抗斑点蛋白抗体(sp100)阳性或阴性者MPO水平； f，PBC患者血清抗糖蛋白210抗体(gp210)阳性或阴性者MPO水平。

图2 MPO水平与PBC患者肝功能和IgM的相关性分析Figure 2 Correlation analysis of MPO level with liver functionand immunoglobulin M in PBC patients

注：a，PBC组；b，HC组；蓝色(DAPI)；红色(MPO)；绿色(H3Cit)。图3 肝组织中免疫荧光共聚焦定位NETFigure 3 Immunofluorescence confocal localization of NETin liver

2.4 PBC患者的外周血中性粒细胞有更强的NET产生能力 分别分离出PBC患者和HC的外周血中性粒细胞，37 ℃孵育4 h，作为空白对照。同时，在两组中性粒细胞中都加入等量PMA，37 ℃刺激4 h，作为阳性对照。无论空白对照组还是阳性对照组，PBC患者的中性粒细胞都能产生更多的NET。上述实验结果提示PBC患者的外周血中性粒细胞有更强的NET产生能力和自发产生NET的倾向(图4)。此外，除去对中性粒细胞自身NET产生能力的观察，本研究同时探索了PBC患者血清在NET产生过程中发挥的作用。将分离出的HC外周血中性粒细胞分别用HC血清和PBC血清进行处理。结果发现，在10%血清的孵育下，PBC患者的血清较HC的血清更易刺激中性粒细胞产生NET。提示PBC患者的血清中存在某些物质或可促进中性粒细胞NET的产生(图5)。

注：a，HC组外周血中性粒细胞空白组；b，PBC组外周血中性粒细胞空白组；c，HC组外周血中性粒细胞PMA组； d，PBC组外周血中性粒细胞PMA组。

3 讨论

自身免疫肝病涉及多种免疫细胞，疾病早期可有肝脏内中性粒细胞聚积的现象[18]。在肝脏炎症中，中性粒细胞浸润胆管数量与疾病进展和胆汁淤积呈正相关[19]。

注：a，外周血中性粒细胞加10%健康人血清孵育后；b，外周血中性粒细 胞加10%PBC患者血清孵育后。

NET在其他自身免疫性疾病中的存在及其相关性提示它在疾病发生发展中起着关键作用[20-22]。目前尚未有研究阐明NET在PBC中的具体作用，笔者观察到NET的产生与PBC患者血清ALP、GGT、AST和ALT水平升高存在正相关。NET是以DNA为骨架，MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、组蛋白等蛋白质附着形成的网状结构，是新近发现的中性粒细胞参与机体免疫的形式。笔者采用ELISA法检测研究对象血清MPO水平来评估NET的含量。虽然这种方法存在一定局限性，但有研究同时使用多指标评估NET水平，疾病组与对照组之间各指标的趋势一致，且以MPO作为衡量NET水平时，疾病组与健康对照组之间差异更为显著[23]。肝组织免疫荧光共聚焦的结果也提示在PBC患者肝脏中有更多的NET产生，在健康对照组则很少呈现NET产生。上述结果或可为缓解PBC患者胆汁淤积提供新的治疗角度。

在白塞病、系统性红斑狼疮等疾病中[24-25]，中性粒细胞自发产生NET的能力增加，本研究也对PBC患者中性粒细胞NET产生能力进行了检测。中性粒细胞在发生NETosis时，细胞膜结构被破坏，活细胞染料Sytox green可以通过受损胞膜进入胞质，将染色质着色。对于胞膜结构完整的细胞，则无法进行核质的染色。笔者观察到PBC患者的中性粒细胞在无刺激的条件下自发产生的NET高于HC组；进一步PMA刺激后，PBC患者NET的产生量仍高于HC组。这些结果提示，PBC患者的中性粒细胞无论是自发产生NET的倾向还是在接受外界刺激时产生NET的能力均较HC组更强。近年的研究表明，NET的过量产生和清除障碍参与了多种肝脏疾病的发生发展，包括缺血再灌注损伤、急/慢性肝衰竭等[26]。除了中性粒细胞本身产生NET的能力和倾向的增强，PBC患者体内是否存在某些因素可以激发中性粒细胞产生NET也是需要关注的问题。笔者猜测PBC患者的血清中可能存在某些物质促进了中性粒细胞产生NET，但是与PMA刺激相比，血清对中性粒细胞产生NET的刺激强度较弱。促进和抑制或者降解NET的成分达到平衡状态，可以维持正常生理状态下人体内很少的NET产生量。但PBC患者体内可能由于刺激产生NET的物质增加或者抑制及降解NET的物质减少，导致二者间平衡被打破，中性粒细胞进而产生了更多的NET，相关机制后续将进一步探究。

伦理学声明：本研究取得所有受试者知情同意，并于2020年8月7日获得上海交通大学医学院附属仁济医院医学伦理委员会的批准，批号：SK2020-003。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：偶绎颜负责所有实验和数据分析、撰写论文；崔娜娜负责收集分析病例资料和ELISA实验；李瑶、钱其炜参与数据收集；马雄、尤征瑞负责课题设计；王绮夏、连敏负责课题设计，指导撰写文章并最后定稿。