一株HIV-1 CRF65-cpx新型重组毒株的检出及基因重组序列分析▲

张培东 梁华悦 黄泫茜 谢海 莫实德 劳飞翔 梁冰玉*

1 防城港市疾病预防控制中心，广西防城港市 538021；2 广西医科大学公共卫生学院&广西艾滋病防治研究重点实验室，南宁市 530021

近年来，全球获得性免疫缺陷综合征(AIDS)流行情况越发严峻。多种HIV毒株在同一地区流行时，HIV复制过程中发生的突变以及病毒之间的基因重组都会增加HIV-1基因型的遗传多样性和复杂性。重组病毒在至少3例及以上无流行病学关联的个体流行，即可鉴定为一种新流行重组型(circulating recombinant form, CRF) HIV毒株[1]。现在，全球已有118 种流行重组亚型(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html)。2015年全国第四次HIV分子流行病学调查发现，4种优势HIV-1 CRF占所有HIV毒株的89.3%，分别是CRF07-BC(41.3%)，CRF01-AE(32.7%)，CRF08-BC(11.3%)和B亚型(4.0%)[2]。广西主要流行的优势HIV 毒株是CRF01-AE，其次是CRF07-BC和CRF08-BC，且有多种新型的重组毒株流行，例如CRF-59-01B、CRF55-01B[3-5]。在多种毒株共同流行的背景下，近年来广西陆续出现许多新的CRF和独特重组型(unique recombinant form, URF)，包括CRF01-AE/CRF08-BC、CRF01-AE/CRF07-BC、CRF01-AE/CRF07-BC/CRF08-BC[6-9]，但尚无含 3种或3种以上基因亚型的新型CRF的研究报道。本研究检测分析发现一种新的CRF65-cpx重组体(B/C/CRF01-AE)，是广西地区首次发现的复杂重组毒株，通过对其每个重组片段进行序列和进化分析，探讨其重组形式的产生与境外、境内毒株的关联，以及此重组型在广西地区是否有散发流行的可能性，可为开展HIV防治工作提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究病例为男性患者，来自中国(广西)越南边境某市，45岁，因异性性行为感染HIV，患者血清样本编号为BFC92。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit (德国QIAGEN)、离心柱吸附法提取血清样本HIV-1 RNA，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 HIV-1基因扩增、纯化和测序 分两轮扩增病毒RNA。第一轮采用 SuperScript Ⅲ First-stand Synthetic System transcriptase试剂盒(美国Invitrogen)将HIV-1 RNA反转录为cDNA，反应体系为25 μL。第二轮以cDNA为模板，采用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 试剂盒(美国Invitrogen)进行巢式PCR扩增，反应体系为50 μL。扩增反应条件如下：94 ℃预热2 min；94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 4 min，进行35个循环，终延伸68 ℃ 10 min，8 ℃保存。两轮PCR扩增后所得PCR产物为近似全长基因组。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切割PCR产物条带回收，其纯化和测序委托北京天一辉远生物科技有限公司进行。PCR扩增引物及测序引物参照文献[10]。

1.4 近似全长基因系统进化树分析 采用 Los Alamos HIV Sequence Database 的在线工具HIV Align对序列进行剪切校正，再用 BioEdit 软件进行手工校对。从Los Alamos HIV Sequence Database(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中下载HIV-1各亚型参考序列，采用 MEGA-X软件、neighbour-joining法、Kimura two-parameter模型构建近似全长基因系统进化树， Bootstrap Replications设置为1 000次，当分支节点自展值(Bootstrap值)大于0.7时，认为该节点置信度较高。

1.5 重组序列断点分析 将得到的近似全长基因序列提交到在线分析软件HIV-1 Sequence Quality Analysis(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QC/index.html)，以 HXB2 为标准参考株，排除序列组装错误后，采用Los Alamos HIV Sequence Database 的在线工具jpHMM模型(jumping profile Hidden Markov Model)(http://jphmm.gobics.de/)进行重组序列断点分析，并利用Los Alamos HIV Database在线工具Recombinant HIV-1 Drawing Tool(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/DRAW_CRF/recom_mapper.html)生成基因序列图；进一步采用MEGA-X软件构建(修饰)亚基因组系统进化树。

1.6 耐药分析 将比对整齐的fasta序列文件上传至斯坦福大学耐药数据库(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)，利用HIV dbProgram模块按照第9.0版本的基因型抗性解释算法筛选出序列中存在的耐药突变位点。

2 结 果

2.1 近似全长基因系统进化树和耐药分析 测序结果显示，序列全长为8900 bp，是以C为骨架，插入CRF01-AE和B亚型片段的流行重组毒株。将本研究获得序列与国内报道的5条CRF65-cpx参考序列[11-12]进行聚类，结果显示6条序列可聚合构成为一个单系聚类，Bootstrap值为95%，提示该毒株是由 CRF01-AE、B及C组成的CRF65-cpx重组亚型(B/C/CRF01-AE)毒株。见图1。耐药分析结果显示，该毒株存在V179D突变，耐药评分10分，对EFV、ETR、NVP、RPV药物敏感。

图1 样本BFC92毒株的近似全长基因系统进化树

2.2 重组序列断点分析 重组序列断点分析结果显示，该序列由14个片段重组而成(见图2A)。参照HIV-1标准毒株HXB2，该毒株的序列位置为790～9412bp，从5′至3′端涵盖了病毒所有的调节基因和结构基因，分别为gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和nef，是较为完整的基因序列，见图2B。

图2 样本BFC92毒株的重组序列断点分析

2.3 分段基因序列进化树分析 样本BFC92毒株近全长基因序列由 CRF01-AE、CRF01-B 和 CRF01-C 组成，序列位置为790～9412bp，含14个片段，其13个断点位置为1170、3803、4015、5655、5830、5993、6378、7586、8349、8506、8568、8830和8995，片段Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ为CRF01-AE亚型，片段Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ为B亚型，片段Ⅱ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅺ和ⅪⅤ为C亚型。对14个重组片段分别构建亚区域基因进化树(见图3)，分析断点位置的置信度，片段Ⅰ(所在区段HXB2：790-1169bp)、Ⅴ(5655-5829)、Ⅶ(5993-6377)、Ⅹ(8349-8505)和Ⅻ(8568-8829)与 CRF01_AE 聚集成簇，其Boostrap 值分别为99%、94%、99%、80%和100%。片段Ⅲ(3803-4014)、Ⅵ(5830-5992)、Ⅸ(7585-8348)和ⅩⅢ(8830-8994)与B聚集，Boostrap 值分别为83%、84%、70%和89%。片段Ⅱ(1170-3802)、Ⅳ(4015-5654)、Ⅷ(6378-7585)、Ⅺ(8506-8567)和ⅪⅤ(8995-9412)与C聚集，Boostrap 值分别为100%、99%、98%、82%和99%。

图3 样本BFC92毒株近似全长基因序列14段片段的亚型分析进化树

3 讨 论

HIV-1重组株是重复感染或合并感染多种亚型形成的[1]。2013年，CRF65-cpx毒株在中国云南异性性传播人群中被检出，这是在中国发现的一种流行HIV重组亚型[11]。既往研究结果显示，CRF65-cpx毒株大约在2000年(1997～2003年)起源于云南省，并于2007年(2005～2008年)传入北京市和安徽省的同性恋人群[13-14]。研究结果表明，CRF65-cpx重组毒株主要在同性恋人群中流行传播，而在云南主要是在异性人群中传播[15-16]。本研究结果显示，在广西异性接触感染HIV-1的患者中鉴定出CRF65-cpx重组体(B/C/CRF01-AE)。

本研究中的HIV-1感染患者具有云南服役史，因异性性传播而感染，推测该患者是在云南服役期间感染此毒株。广西与云南相邻，CRF65-cpx毒株很容易从云南传入广西。本研究结果显示，重组毒株(B/C/ CRF01-AE)的B亚型基因片段(Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和ⅩⅢ)与泰国B亚型毒株存在聚类，CRF01-AE亚型插入片段(Ⅰ、Ⅴ、Ⅹ和Ⅻ)与越南北部IDU流行的CRF01-AE毒株聚类[17-18]；该重组毒株(B/C/CRF01-AE)与在云南异性人群中首次发现的CRF65-cpx毒株具有很高的同源性。

既往研究结果显示，CRF01-AE和B亚型耐药相关位点的突变频率较高，毒株中V179D/E突变发生频率为11.06%(6.24%～17.00%)，偶见于使用依非韦伦(EFV)治疗的HIV感染患者[19]。Liu等[20]报道，在我国7个省流行的CRF65-cpx毒株存在V179D突变。毒株发生V179D/E突变会导致未接受抗病毒治疗的HIV感染患者对非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)药物的敏感性降低。本研究结果显示，重组毒株(B/C/CRF01-AE)存在V179D突变，可判定为潜在耐药[19,21-23]，因此对携带CRF65-cpx毒株HIV感染患者的临床治疗具有一定的挑战性，需要加强对患者病毒载量和耐药的监测。

综上所述，在广西边境某市发现的CRF65-cpx病毒株是由B、C和 CRF01-AE亚型毒株重组而成，且含有V179D突变。广西边境地区应加强对该亚型或类似新型病毒株的监测并采取相应的预防控制措施，以防止境外新型重组毒株或本地重组毒株在该地区的扩散传播流行。