含乌梅方剂数据挖掘及乌梅-人参治疗糖尿病的网络药理学分析*

魏稚力，张小波，高蕊，简胜男，马晓菊，文跃强，周昕，沈涛

成都中医药大学基础医学院 四川成都 610072

糖尿病（Diabetes Mellitus， DM）作为全球性公共卫生问题，严重危害人类健康。据2017年相关报道，目前全球共有4.25亿成人DM患者，而我国这一数字高达1.14亿，居世界首位[1]。现降糖药种类繁多，因其各自临床特点与不良反应，寻求更加安全有效的治疗药物一直是该疾病的研究热点[2]。DM属中医“消渴”范畴，但二者并不能等同[3]。相较于现代DM以血糖升高为主要诊断依据，消渴则以多饮、多食、多尿、消瘦等“三多一少”症状为典型表现[4]。消渴虽不等同于现代DM，但对于DM的治疗亦可从“消渴”相关中医治疗获益。大量研究显示，中医药治疗可发挥降低患病风险、降低血糖，改善胰岛素抵抗、提高胰岛素敏感性、改善DM症状及其并发症损伤等多种治疗作用[4-8]。鉴于此，基于中医药资源挖掘治疗DM的有效药物组合具有积极研究意义。

有关乌梅功效应用，《本经》[9]云：“下气，除热烦满，安心，肢体痛，偏枯不仁，死肌，去青黑志、恶疾。”《景岳全书》载其：“止消渴……消痈疽疮毒”[10]。2015年版《中国药典》[11]载其用于：“虚热消渴”。现代化学药理研究报道，乌梅中有机酸成分——苹果酸、枸橼酸可降低正常小鼠血糖水平，乌梅果肉中三萜类成分——熊果酸、齐墩果酸具有降血糖作用[12，13]。临床研究报道，乌梅丸可降低2型DM患者血糖水平[14]。除临床药用外，乌梅作为一种药食同源性资源，亦被广泛运用于大众生活当中，如用于各类乌梅饮品及凉果蜜饯的制作等。鉴于乌梅药用价值及开发应用前景，本研究对《中医方剂大辞典》中含乌梅方剂进行收集整理，并运用TCMISS进行数据挖掘分析。在此基础上，选取乌梅-人参核心药对，并运用网络药理学方法进一步探讨该药对治疗DM的潜在作用机制，以期为乌梅的临床运用及后续研究提供更多参考。

资料与方法

1 方剂来源

以“乌梅”为检索关键词（“乌梅肉”“大乌梅”“乌梅炭”等均作为药物乌梅纳入检索结果）对《中医方剂大辞典》[15]中含乌梅方剂进行筛取。

2 数据规范

主要涉及中药因产地、别名、炮制加工、入药部位等情况进行药名规范处理，主要参照2015年版《中国药典》[11]及《中药别名大辞典》[16]对所筛方剂进行药名规范。

3 中医传承辅助系统分析

3.1 数据录入 通过TCMISS“平台管理”模块的“方剂管理”功能，将方名、方源、组成、主治疾病等信息录入系统建立数据库，并由双人进行数据核对与校正。

3.2 统计与关联规则分析 运用TCMISS“数据分析”模块之“方剂分析”、“数据查询”等功能，辅以Excel数据表格，对查询出的目标方剂进行相关统计与关联规则分析。

4 网络药理学分析

4.1 有效成分的收集 借助TCMSP检索乌梅和人参中的化学成分。一般认为药物动力学（ADME）性质中口服生物利用度（OB）和类药性（DL）具有重要意义，满足OB≥30%和DL≥0.18的化合物通常被认为是潜在的活性成分，故以此为标准进行活性成分的筛选。同时，在TCMSP上下载符合条件成分的分子结构，保存为MOL2格式。4.2 成分潜在靶点预测及疾病靶点获取 将前一步获得的成分结构导入Swiss Target Prediction数据库以获得各成分的作用靶点，并对获取的靶点进行合并、去重。在Genecards数据库中以“Diabetes mellitus”为关键词检索DM的相关治疗靶点，保留相关性得分大于20的靶点。之后将获得的成分靶点与疾病靶点进行取交集。

4.3 PPI网络构建 将Swiss Target Prediction数据库获得的靶点导入 STRING 网络平台，蛋白种类定义为“人”，置信度>0.7设为筛选条件进行筛选，获得蛋白互作关系，下载TSV格式文件。将TSV文件信息导入Cytoscape3.7.1中，并运用其插件“Network Analyze”分析网络拓扑参数，以节点度值、介数均超过平均值为标准筛选出核心靶点。

4.4 GO富集分析与KEGG通路富集分析 利用R软件的Bioconductor数据包对PPI中所涉及的核心调控基因进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，并画出富集分析的气泡及柱状图。

结 果

1 统计与关联规则分析

本研究共筛取整理出《中医方剂大辞典》含乌梅方剂1373首，涉及中药663味。其中用药频次前20位的药物，见表1，可见除甘草外，乌梅最常与人参联用。根据《中药学》[17]药物分类标准，对常与乌梅联用的前100位药物进行分类统计，见表2，提示乌梅常与补虚药、清热药、解表药、理气药、温里药、化痰止咳平喘药等联用。基于关联规则Apriori算法，分析48首含乌梅治疗消渴方剂的用药规则，得到支持度≥0.29，置信度为1的含乌梅治疗消渴的强关联规则药对组合（核心药对），见表3。筛得含乌梅-人参主治消渴的历代方剂11首，见表4。

表1 含乌梅方剂前20位常用药物（频次≥119）

表2 常与乌梅联用的前100位药物的分类情况

表3 含乌梅治疗消渴的强关联规则药对组合（核心药对）

表4 含乌梅-人参主治消渴方剂

2 乌梅-人参药对治疗DM的网络药理学分析

2.1 乌梅、人参活性成分 基于TCMSP共获得27个成分，得到乌梅活性成分8个，人参活性成分22个，其中Stigmasterol、beta-sitosterol和kaempferol为二者共有成分，见表5。

表5 乌梅-人参活性成分基本信息

2.2 成分潜在靶点 通过Swiss Target Prediction预测并提出重复目标后，共得到627个乌梅、人参的治疗靶点。Genecards数据库分析得到DM相关靶点301个。将成分靶点与疾病靶点进行取交集后共得到52个共同靶点，见图1。

图1 乌梅-人参疾病-成分靶点韦恩图

2.3 PPI分析 在PPI网络中，具有较高“度”值的节点通常认为是关键靶标蛋白。如图2所示，AKT1（21）、TNF（20）、VEGFA（20）、MAPK1（18）、STAT3（18）、TP53（18）、MAPK8（16）、PIK3CA（15）具 有 较 高的度值，在网络调控中起关键作用，其很可能是乌梅-人参药对治疗DM的关键靶标蛋白。

图2 关键靶标蛋白信息条形图

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 GO富集分析描述了一系列复杂的事件，这些事件是由一个或多个层次通过组织良好的协同作用来完成的。如图3所示，展示了前20条GO途径，主要集中在激素结合、类固醇激素受体活性、胰岛素受体底物结合、核受体活性、胰岛素样生长因子受体结合、胰岛素受体结合等方面。KEGG前20条途径主要集中在DM并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、胰岛素抵抗、内分泌抵抗、VEGF信号通路、II型糖尿病、TNF信号通路、Rap1信号通路等通路上，见图4。

图3 前20条GO富集途径

图4 前20条KEGG通路富集途径

讨 论

中医药防治DM多从“消渴”论之。消渴传统病机以“阴虚燥热”为主论，治以滋阴清热，并分消论治[18]。但气与津液关系密切，津液之生成、输布、排泄，有赖于气的推动、固摄及升降出入运动，而气亦离不开津液之滋润与运载[19]。《神农本草经疏》[20]云：“消渴者，津液不足之候也，气回则津液生，津液生则渴自止矣。”随着现代医家对DM临床实践与认识的不断深入，对于DM中医核心病机的概括亦出现了新的认识。沈绍功教授对538例2型DM患者进行辨证调研，发现气阴两虚证高达77.51%，明显高于传统阴虚燥热证，之后进一步提出转变对2型DM “阴虚燥热”病机的一般认识，并以“气阴两虚侧重气虚”为消渴之病机关键[21]。张延群等收集2080例DM患者临床资料，统计显示气虚证频率达88.75%，居首位，高于阴虚证的64.09%[22]。谢春光教授提出“气阴两虚”为现代DM发生发展的核心病机，并以益气养阴为治疗原则，自拟方“参芪复方”获得良好临床疗效[23]。可见“益气养阴”对于现代DM防治的重要指导意义。

本研究以含乌梅方剂数据挖掘为切入点，从频次来看，尽管甘草亦属补气药且频次高于人参，但其在许多方剂中常作调和药性之用，且在配伍中常与人参同用或辅助人参发挥补益类作用，如炙甘草汤（《伤寒论》）、四君子汤（《局方》）等[24]。此外，在基于关联规则分析得到的核心药对中，除人参、甘草外，麦冬、葛根、天花粉并不属补气药。故本研究优先选取乌梅-人参这一核心药对，并进一步探讨其治疗DM的潜在作用机制。

乌梅酸敛，生津除烦；人参甘补，益气生津。二药相伍，相辅相成，益气同时养阴生津之功益彰，具“酸甘化阴”之义。酸甘化阴法用治消渴由来已久，首见于仲景所制之肾气丸，方中山茱萸与干地黄、山药伍用，酸甘化阴，亦寓阴中求阳之意。此外，诸如口含酸枣丸（《备急千金要方》）、六味地黄丸（《小儿药证直诀》）、乌梅四物汤（《医门八法》）、生脉散（《医学启源》）、玉泉丸（《杂病源流犀烛》）等典型酸甘化阴法配伍的方剂亦被广泛用于消渴的临床治疗[25，26]。研究报道，乌梅作君药的酸甘化阴法方剂可改善气阴两虚型2型DM患者中医证候，并降低空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数[27]。乌梅-人参药对切合消渴“气阴两虚”病机，亦是中医酸甘化阴法之典型运用，其对于现代DM的相关研究值得进一步深入。

本研究进一步运用网络药理学方法对乌梅-人参药对进行DM相关作用机制探讨。TCMSP搜集得到二药共有27个成分，可作用于52个DM相关靶点。PPI网 络 分 析 表 明AKT1、TNF、VEGFA、MAPK1、STAT3、TP53、MAPK8和PIK3CA可能是乌梅-人参治疗DM的主要靶点。TNF是一组可以引起细胞死亡的细胞因子，该家族包括两个成员，TNF-α和TNF-β。其中TNF-α参与了全身炎症反应，同时它可以通过减弱胰岛素的信号转导途径，减少脂肪细胞中的葡萄糖转运，以及抑制脂联素等方式在胰岛素抵抗中发挥重要作用[28]。STAT3是STAT家族中的成员，其除了参与癌细胞的信号传导，还在调节糖类及脂质代谢， 维持机体内环境稳态等方面扮演着重要角色。研究表明，STAT3可通过抑制肝脏糖异生的关键基因Pck1和G6pc来改善胰岛素抵抗症状[29]。P53蛋白由17号染色体上的P53基因编码，P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，并与胰岛素抵抗关系密切，是治疗DM的新靶点[30]。

KEGG分析显示，52个与DM相关的靶点主要富集在胰岛素及胰岛素并发症相关通路上。胰岛素抵抗是引起DM的重要原因。通常，肥胖诱发的慢性炎症会引起IL-6、TNF-α等炎性因子的增加，而TNF-α会诱导JNK的激活，激活的JNK可以使胰岛素信号通路中IRS蛋白上的Ser位点磷酸化，导致其相应Tyr位点的磷酸化降低，从而使下游的PI3K、AKTV蛋白不能被活化，从而产生胰岛素抵抗[31]。IL-6可以激活STAT3，诱导SOCS蛋白表达，进而抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，使胰岛素PI3K信号转导受阻，最终引起胰岛素抵抗[32]。PPI网络分析表明乌梅-人参药对可以与关键靶点TNF、STAT3和PIK3CA产生作用，因而其可能通过调节胰岛素抵抗通路中的TNF-α/JNK/PI3K或IL-6/STAT3/PI3K途径来治疗DM，如图5所示。

图5 胰岛素抵抗信号通路图

综上，本研究通过整理《中医方剂大辞典》中含乌梅方剂，运用中医传承辅助系统对其进行数据挖掘，并以DM “气阴两虚”病机为切入点，选取乌梅-人参核心药对进行DM相关网络药理学机制探讨，可为乌梅的临床用药及后续开发研究提供有益线索。基于中医药数据挖掘与网络药理学分析可为进一步研究提供方向，但还需要进一步实验验证，从而更加系统、科学地阐述乌梅-人参防治DM的机制。