肉苁蓉防治宫腔粘连的作用机制研究*

李敏艳，刘文娥，安建平，杨琴

1 湖南中医药大学研究生院 湖南长沙 410007

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）是妇科常见疾病，由宫腔机械操作、炎性反应等多种原因引起子宫内膜基底层损伤，使子宫内膜发生粘连或纤维化，导致宫腔部分或完全封闭的病理症状。临床常表现为月经量减少、闭经、盆腔疼痛及不孕等症状，严重影响育龄期女性生殖及身心健康。

肉苁蓉其性味甘、咸，温；归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效[1-2]。有研究表明[3]肉苁蓉具有类性激素样的效应，能调整肾-天癸-冲任-胞宫轴，改善机体盆腔内环境，促进子宫内膜间质和腺体的修复和增殖。因此，本论文应用网络药理学研究方法探索“补肾”类中药肉苁蓉对IUA的作用机制，为临床上IUA药物的使用及早期干预提供理论依据，在临床上具有重要的意义。

资料与方法

1 肉苁蓉活性成分与基因靶点的获取

在TCMSP数据库中，将药物筛选阈值设定为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，检索肉苁蓉的活性成分及对应的靶蛋白。利用Uniprot数据库和Perl语言，将靶蛋白转化为对应基因名。

2 IUA靶点基因收集

在GeneCards、OMIM、PharmGkb这三个数据库中，以“intrauterine adhesion”为检索词，分别检索出IUA疾病靶基因，取并集获得IUA的疾病靶基因集。

3 肉苁蓉防治IUA潜在靶点的获取

利用R语言软件将肉苁蓉药物靶基因与IUA疾病靶基因取交集，获得肉苁蓉防治IUA的潜在靶点，并构建Venn图。

4 肉苁蓉防治IUA的“药物-活性成分-潜在靶点”网络构建

将肉苁蓉活性成分与潜在靶点相匹配，采用Cytoscape3.8.0软件构建“药物-活性成分-潜在靶点”网络图。利用插件Network Analyzer进行拓扑学分析筛选出肉苁蓉防治IUA的关键活性成分。

5 肉苁蓉防治IUA互相作用蛋白网络图（PPI）构建

将获得的潜在靶点导入String数据库，构建PPI网络。利用CytoNCA插件进行参数设置，挖掘该调控网络中的关键靶点。

6 GO和KEGG富集分析

运用R语言调用Bioconductor数据包对潜在靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，对分析结果进行可视化，构建“通路-潜在靶点”网络图。

7 分子对接验证

将筛选出的核心靶点和关键有效成分进行分子对接验证。在Pubchem和PDB数据库中分别获取对接小分子和靶基因的大分子蛋白构像。运用AutoDock1.5.6软件进行分子对接，计算对接自由能，筛选出最佳、最合理的对接方式进行分析验证。

结 果

1 肉苁蓉的主要活性成分作用靶点

在TCMSP数据库中共得到肉苁蓉活性成分5个，分别为β-谷甾醇（beta-sitosterol）、花生四烯酸（arachidonate）、全草含苏齐内酯（suchilactone）、木脂素（Yangambin）、槲皮素（quercetin），其对应靶蛋白共221个，在Uniprot数据库中将靶蛋白转化为对应的基因名，去重后获得靶基因154个。

2 疾病靶标的筛选

在Genecards、OMIM、PharmGkb数据库分别筛选出疾病靶点3279个、95个、971个，取并集共获取肉苁蓉防治IUA的疾病靶点3880个，与肉苁蓉药物靶点取交集，得到药物-疾病潜在靶点117个，构建Venn图（见图1）。

图1 肉苁蓉防治宫腔粘连交集基因Venn图

3 构建药物-活性成分-潜在靶点网络

运用 Cytoscape 3.8.0软件构建“药物-活性成分-潜在靶点”网络图，共有节点123个，150边条，有效成分按对应的潜在靶点数值大小（degree值）进行排序，分别为槲皮素113个、β-谷甾醇21个，全草含苏齐内酯7个，木脂素5个，花生四烯酸4个（见图2）。由此可知肉苁蓉在治疗IUA时槲皮素和β-谷甾醇可作用于多靶点发挥主要作用，而其他活性成分参与并不多，说明槲皮素和β-谷甾醇可能是肉苁蓉治疗IUA的关键活性成分。

图2 肉苁蓉防治IUA“药物-成分-潜在靶点”网络图

4 PPI网络图构建

在STRING数据库对117个潜在靶点进行相互作用分析，设置combined score>0.9，输出目标文件，导入Cytoscape3.8.0软件中绘制PPI网络图，共得到99个节点和340条边的（见图3A），运用CytoNCA插件设置参数进行两次筛选，获得肉苁蓉治疗IUA的核心靶点基因为JUN、MAPK1、AKT1、TP53、RB1、TNF、CCND1、RELA、MYC等9个（见图3B、3C）。

图3 肉苁蓉防治IUA共同靶点PPI网络图

5 GO和KEGG分析

通过GO功能富集分析，肉苁蓉与IUA相关的潜在关键靶点基因涉及生物过程（Biological Process，BP）富集条目2086条，主要包括细胞对化学应激的反应、脂多糖的反应、活性氧代谢过程等；细胞组成（cellular component，CC）52条，主要包括膜筏、膜微域、膜区等；分子功能（molecular function，MF）148条，主要包括DNA聚合酶转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等（见图4）。

图4 肉苁蓉防治IUA潜在靶点GO气泡图

KEGG富集分析结果显示共154条通路，其主要涉及代谢、肿瘤、病毒感染、炎性反应等多种信号通路（见图5）。以通路富集的基因数目对排序前20的通路及对应的基因导入Cytoscape3.8.0中构建“潜在靶点-通路”网络并进行可视化（见图6A）。根据Degree值取排名前10的靶蛋白制作柱状图（见图6B），依次为 AKT1、MAPK1、TP53、RELA、CCND1、CDKN1A、RAF1、CASP3、TNF、BAX。

图5 肉苁蓉防治IUA潜在靶点KEGG气泡图

图6 肉苁蓉预防IUA“潜在靶点-通路”网络图

6 分子对接验证结果

将PPI网络和KEGG富集分析获得关键靶点取交集获得核心靶点为AKT1、MAPK1、TP53、TNF、RELA、CCND1。并与肉苁蓉的活性成分逐一进行分子对接。将对接结果绘制成热图（见图7A）。根据配体和受体结合能越低，结合越稳定的原理，可以看出槲皮素、β-谷甾醇与关键靶点结合效果较佳，其中槲皮素与RELA对接效果最佳，能量为-9.7kcal/mol，分子对接情况如图所示（见图BCD）。

图7 A图为肉苁蓉主要活性成分与核心靶基因对接能量值热图；B图为槲皮素与RELA对接分子结构图；C图为β-谷甾醇与AKT1对接分子结构图；D图为全草含苏齐内酯与RELA对接分子结构图。

讨 论

IUA在中医传统医学中属于“月经量少”“闭经”“不孕”等范畴。IUA多由金刃损伤所致，金创之法对胞宫造成损伤，导致胞脉、冲任、气血受损，耗伤肾之元气精血，而肾为先天之本，主生殖，为天癸之源，冲任之本，气血之根，故多出现经少、闭经，不孕等情况。后代医家认为宫腔粘连的病机为肾虚血瘀，肾虚为本，血瘀为标，属本虚标实，故治疗当以补肾为主。

本研究检索出肉苁蓉的五种有效成分，推断出槲皮素、β-谷甾醇为肉苁蓉防治IUA的关键有效成分。分子对接结果也证实槲皮素、β-谷甾醇对接结果较其他活性成分更佳，推测出槲皮素、β-谷甾醇是肉苁蓉防治IUA发挥作用的主要成分。通过GO分析，推断肉苁蓉防治IUA的作用机制是通过有效成分和某些DNA/RNA聚合酶转录因子、泛素样蛋白连接酶等结合调节活性氧代谢、参与细菌来源分子反应、炎症反应、氧化应激等生物过程实现的。现代药理学表明，槲皮素、β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗纤维化等生物活性[4-5]。槲皮素具有清除氧自由基及超氧阴离子，并通过提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，可以减轻组织的氧化应激损伤和病理性修复[6-8]。槲皮素还可调控TLR4/NF-kB通路，调节NO释放，降低TNF-α、IL-1β等炎症因子的分泌，减轻炎症反应，并抑制细胞的凋亡[9-10]。研究发现β-谷甾醇也可调控NF-kB/MAPK信号通路减少细胞中炎性因子生成，发挥抗炎，抗氧化作用，减轻细胞的损伤[11-12]。此外，β-谷甾醇可减少细胞外基质CollagenⅠ的沉积，促进α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，抑制组织、器官纤维化病理过程[13]。

肉苁蓉防治IUA筛选出核心靶点为AKT1、CCND1、MAPK1、RELA、TNF、TP53，预测肉苁蓉防治IUA主要通过调节这些基因靶点发挥作用。目前大量实验研究[14-15]发现抑制TNF、IL炎症因子和TGF-β1、MAPK1、AKT蛋白的分泌，可减轻IUA的粘连程度，其机制主要与减轻子宫内膜修复过程中炎症反应及纤维化的发生，促进子宫内膜的修复与再生。RELA是NF-kB信号通路中的重要转录因子，可调控 TNF-α、IL-17等多种炎性介质的表达来介导炎症反应，参与细胞免疫及凋亡等生物过程[16]。宫腔内的肿瘤也是引起IUA重要原因之一，TP53、CCND1主要调节细胞增殖分化，从而影响IUA的发生发展。

KEGG分析结果显示，其富集通路主要涉及炎症反应、病毒感染、恶性肿瘤及内分泌紊乱等方面，主要包括AGEs-RAGE、HIF、TNF、IL等通路及通路调控因子。AGEs-RAGE信号通路是抗纤维化的主要通路之一，糖化终产物（AGEs）可以刺激单核巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1等因子来促进细胞基质中层连蛋白（Laminin）的表达，诱导间皮细胞合成基质增加，导致大量基质蛋白堆积或基质成分被AGEs修饰而发生结构改变，最终诱发纤维化病理改变[17]。此外，AGEs-RAGE通路还可以调控上皮细胞内氧化酶系统，促进炎症因子的表达，导致细胞炎症损伤与凋亡[18]。HIF在IUA患者子宫内膜中表达，并与IUA的粘连纤维化成正相关，HIF可调控缺氧调节机制，缺氧时HIF-1α诱导p53上调抑制细胞周期进程，导致G2/M细胞的积聚，并激活TGF-β、CTGF等因子，促进纤维化的发生[19]。TNF-α、IL作为纤维化因子、炎症介质和免疫调节因子，与IUA的发生发展密切相关，促进炎症反应，刺激血管收缩，使子宫内膜缺血缺氧情况加重，促进IUA的形成[20]。

综上，本研究通过网络药理学预测肉苁蓉防治IUA的分子机制研究得出槲皮素、β-谷甾醇是肉苁蓉预防IUA关键有效成分，主要通过作用AKT1、MAPK1、RELA、TNF等基因靶点来调节AGE-RAGE、HIF、TNF等多条信号通路发挥作用，其作用生物机制与调控纤维化、炎症反应、氧化应激反应、细菌病毒感染等密切相关。这些机制有部分在当前已有的文献中得到证实，但仍有部分机制可能需要后续实验研究加以证明。因此，对肉苁蓉防治IUA的分子机制的研究有一定参考价值，可为后续实验设置提供思路。