基于系统生物学比较温病“辛凉三剂”方证的病理机制差异*

胡莉，白辰，刘邵阳，龙超君，于河，谷晓红，刘铁钢

北京中医药大学中医学院 北京 100029

吴瑭·《温病条辨》中分别称桑菊饮、银翘散、白虎汤为辛凉轻剂、辛凉平剂、辛凉重剂，其依据三方透邪外达力度而有轻、中、重程度之分。桑菊饮和银翘散皆是辛凉解表之剂，白虎汤为清气分热的处方。但在透邪外达的作用上三者是一致的。用于卫分证的桑菊饮解表之力稍弱，主要为清肃肺气、宣肺止咳，故称辛凉轻剂；银翘散辛透凉泄，透泄力介于桑菊饮和白虎汤之间，故称辛凉平剂。《温病条辨》言：“白虎本为达热出表”，又称：邪重，非其力不举。可见白虎汤透邪力在三者中最强，因其辛透寒泄，大清气分邪热，故称辛凉重剂。

辛凉轻剂桑菊饮证表征为咳嗽，身热不甚，口微渴；其证质为肺失宣降，证治以宣肺为主。辛凉平剂银翘散证表征为发热，微恶风寒，无汗或有汗不畅，头痛口渴，咳嗽咽痛；其证质为风热邪气侵袭肺卫、卫外失司，证治以泄卫为主。辛凉重剂白虎汤证表征主治壮热面赤，烦渴引饮，汗出恶热；其证质为肺胃热炽，证治以清热生津为主。三个方证方药组合虽各有侧重，然皆轻清突出。临床孰去孰从，权在灵活。

随着基因、蛋白、代谢组技术的发展，系统生物学——在于研究细胞信号传导和基因调控网络、生物系统组成之间相互关系的结构和系统功能的一门新学科顺势而生。以构建“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”网络为方法，从改善或恢复生物网络平衡的角度来认识方证生物学机制的比较，对生物系统网络进行整体分析[1]。本研究用系统生物学方法，构建了“辛凉三剂”方证表征的“表征-基因-靶点”网络，并对其进行基于功能与通路分析，借以阐述“辛凉三剂”方证证治的作用机制及差异。

资料与方法

1 一般资料

第七版《方剂学》[2]记载：“桑菊饮主治症状：咳嗽，身热不甚，口微渴，脉浮数。银翘散主治症状：发热，微恶风寒，无汗或有汗不畅，头痛口渴，咳嗽咽痛，舌尖红，苔薄白或薄黄，脉浮数。白虎汤主治症状：壮热面赤，烦渴引饮，汗出恶热，脉洪大有力。”

2 数据库及软件

中药靶点数据库SymMap[3]（http://www.symmap.org），HPO数据库[4]（https://hpo.jax.org/、PolySearch2文献挖掘工具[5]（http://polysearch.cs.ualberta.ca/），蛋白质相互作用数据库String[6]（https://string-db.org/），基因注释和分析资源Metascape[7]（http://metascape.org）。网络可视化工具 Cytoscape 3.7.2[8]。

3 “辛凉三剂”方证表征相关靶标基因获取

本研究采用数据库检索与文献挖掘两种方式结合获得“辛凉三剂”方证表征的相关靶标基因。利用SymMap数据库、HPO数据库、PolySearch2文献挖掘工具，以桑菊饮证的“咳嗽”、“身热不甚”、“口微渴”；银翘散证的“发热”、“微恶风寒”“无汗”、“头痛”、“口渴”等；白虎汤证的“壮热”、“面赤”、“大渴”、“大汗”等关键词检索“辛凉三剂”方证表征相关靶标基因后取其并集，去除重复基因及Uniprot数据库[9]（http://www.uniprot.org/）中未经注释的或不属于人类的靶点，得到“辛凉三剂”方证表征对应的SymMap terms和HPO terms条目。并利用OmicShare[10]网站（http://www.omicshare.com/），把“辛凉三剂”方证表征靶标之间关系以韦恩图展示。

4 靶点蛋白的生物功能分析

以String 数据库作为背景网络数据库，分别将桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证的靶点蛋白导入，选择研究物种为“Homo sapiens”，以0.95作为最低交互得分，以数据库、实验及文献挖掘为网络交互来源，构建“辛凉三剂”方证表征的有效靶点互作（Protein-Protein Interaction，PPI）网络，保存为TSV格式文件。

5 网络可视化与核心网络构建

为了使网络关系更为直观，本研究应用 String 数据库以TSV文件保存的结果在软件 Cytoscape 3.7.2上构建“表征-基因”可视化网络，并根据Degree值（连接度）调节节点的大小、颜色，以更直观地呈现靶标之间的相互作用关系；并利用其MCODE拓展功能筛选核心网络，选择MCODE SCORE前三的核心网络，并记录其Node和Edge值。

6 基因功能和通路富集分析

利用MetaScape平台，从“辛凉三剂”方证的“表征-基因”网络中选取MCODE 得分最高的第一聚类相关基因进行分析，将预测靶标基因上传至David数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行GO富集分析[选择生物过程，分子功能和细胞组成3个模块]和KEGG通路分析。利用 Cytoscape 的 MCODE 功能筛选基因功能和通路的核心网络，筛选出Pvalue<0.001的通路，并根据其上富集的基因数进行降序排列，选取排名前20的通路，使用OmicShare网站（http://www.omicshare.com/）将结果以高级气泡图的形式展现。

结 果

1 相关基因检索

针对桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证三个方证的表征，在中药靶点数据库SymMap、HPO数据库上手动检索了尽可能多的terms。例如，对于症状“发热”，在中药靶点数据库SymMap中通过“发热”进行检索；通过关键字和其他同义词（例如“Recurrent fever”）搜索了HPO数据库，并找到了三个具有相似含义的HPO术 语：“Fever”（HP:0001945），Recurrentfever（HP:0001954），Unexplainedfevers（HP:0001955），Periodic fever（HP:0032323）。如表1-3所示，大多数表征有几个对应的SymMap terms和HPO terms，而一些“有汗不畅”“身热不甚”“恶热”等表征未包括在数据库中。

表1 桑菊饮证表征的相应terms

2 “辛凉三剂”方证靶标预测

经检索桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证三个方证的表征，获得Genes列表，并将桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证三个方证表征的相关靶标基因取其并集，去除重复基因及Uniprot数据库中未经注释的或不属于人类的靶点。得到桑菊饮证表征涉及蛋白靶点244个，银翘散证表征涉及蛋白靶点410个，白虎汤证表征涉及蛋白靶点172个。桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证表征的靶标基因的相互关系见图1。

图1 三方证映射靶标韦恩图

表2 银翘散证表征的相应terms

表3 白虎汤证表征的相应terms

Y1代表银翘散证，y2代表桑菊饮证，y3代表白虎汤证。“辛凉三剂”方证表征共有的靶标基因有8个；银翘散证和桑菊饮证表征中共有而白虎汤证中没有的靶标基因有235个，银翘散证和白虎汤证表征中共有而桑菊饮证中没有的靶标基因有26个，桑菊饮证和白虎汤证表征中共有而银翘散证中没有的靶标基因为0个；桑菊饮证表征中有而白虎汤证和银翘散证中都没有的靶标基因有1个，银翘散证表征中有而桑菊饮证和白虎汤证中都没有的靶标基因有140个，白虎汤证表征中有而银翘散证和桑菊饮证中都没有的靶标基因有138个。

3 基因间互作关系分析

利用String 数据库及Cytoscape网络可视化工具构建“表征-基因”网络，得到桑菊饮证表征基因间互作关系28个，银翘散证表征基因间互作关系42个，白虎汤证表征基因间互作关系19个。利用Cytoscape将“表征-基因”网络可视化并使用MCODE工具获得该网络的核心部分，各个网络节点的大小由其连接度（相邻网络节点的数目）决定：节点越大尺寸越大则该节点连接度越高，具体见图2-5。

4 方证通路GO富集结果

对三个方证的基因分别进行基因富集分析后，桑菊饮证获得GO生物进程168个；银翘散证获得GO生物进程288个；白虎汤证获得GO生物进程71个。三个方证涉及的生物学进程结构和相互关系基本相似，在GO生物进程可映射的基因上存在差异。桑菊饮证映射了27个基因、桑菊饮证映射了40个基因、桑菊饮证映射了19个基因。桑菊饮证和银翘散证共有的基因有26个，为TNF、CCL2、CCR1、HP、IL10、BTK、ERCC5、ERCC3、HBB、ERCC4、BLNK、ERCC2、IL6、NCF2、NCF1、NCF4、HBA2、HBA1、STAT3、XPA、CYBA、CYBB、XPC、DDB2、CD79B、CD79A；银翘散证和白虎汤证共有基因3个，为EDARADD、EDAR、EDA；桑菊饮证和白虎汤证无共有基因；桑菊饮证独有的基因为CXCL8；银翘散证独有的基因为CHEK2、ERCC8、APP、APOA1、APOE、IL1B、THPO、TP53、BRCA2、JAK2、MPL；白虎汤证独有的基因为HSP90AB1、ORAI1、HSP90AA1、STIM1、HSPA1B、ITPR2、TMEM67、HSPA1L、HSPH1、NPHP4、HSPA2、HSF1、HSPA4、DNAJB1、HSPA9、NPHP1。桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证在GO 生物过程经 MCODE 筛选后得到核心条目分别为18条、9条、7条。具体分析结果见图6。

5 方证通路KEGG富集结果

经富集分析后，桑菊饮证获得KEGG通路86个；银翘散证获得KEGG通路108个；白虎汤证获得KEGG通路50个。三个方证共同涉及的信号通路18个；桑菊饮证和银翘散证共有的信号通路有65个；银翘散证和白虎汤证共有的信号通路有4个；桑菊饮证和白虎汤证无共有的信号通路；桑菊饮证独有的信号通路有3个；银翘散证独有的信号通路有21个；白虎汤证独有的信号通路有28个。

为了更加系统地分析目标靶点的生物学功能，我们运用KEGG的PATHWAY数据库部分对目标靶点进行PATHWAY通路分析。得到桑菊饮证相关通路52条（P-Value<0.01），银翘散证相关通路46条（P-Value<0.01），白虎汤证相关通路18条（PValue<0.01）。通过OmicShare平台将分析结果转化为高级气泡图（见图7-9）。

图3 银翘散证的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”网络及核心模块

图4 白虎汤证的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”网络及核心模块

图5 “辛凉三剂”方证表征（Symptoms）的基因（Targets/Genes）网络

图7 桑菊饮证靶标的KEGG通路富集分析

在P-Value<0.01的桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证的富集通路分别有52条、46条、18条，其相互之间的关系如图10。图中所示，“辛凉三剂”方证表征共有的富集通路有5条，以NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）为主；银翘散证和桑菊饮证表征中共有而白虎汤证中没有的富集通路有36条，以细胞因子与细胞因子受体的相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、趋化因子信号通路（Chemokine signaling pathway）、B细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）为主；银翘散证和白虎汤证表征中共有而桑菊饮证中没有的富集通路为0条；桑菊饮证和白虎汤证表征中共有而银翘散证中没有的富集通路为1条，是EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）可能相关性疾病；桑菊饮证表征中有而白虎汤证和银翘散证中都没有的富集通路有10条，以T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）为主；银翘散证表征中有而桑菊饮证和白虎汤证中都没有的富集通路有5条，以Jak-STAT信号通路（Jak-STAT signaling pathway）为主；白虎汤证表征中有而银翘散证和桑菊饮证中都没有的富集通路有12条，以MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）为主。

图8 银翘散证靶标的KEGG通路富集分析

图9 白虎汤证靶标的KEGG通路富集分析

图10 P<0.01的辛凉三剂方证的富集通路

讨 论

辛凉三剂方证均为外感风热病邪侵犯人体后不同的病变阶段，故本篇旨在通过构建“辛凉三剂”方证表征-基因-通路网络，探讨温病“辛凉三剂”方证的病理机制差异。《温热论》中“温邪上受，首先犯肺”指出，由于肺主气属卫，与皮毛相合，卫气敷布于皮毛，故风温病邪外侵，肺卫首先受其影响，卫气闭郁，肺气失宣，故有发热微恶寒，咳嗽等表现。肺卫之邪感邪不甚，经及时治疗后可获痊愈。若感邪较重，或肺卫之邪不解，则其可发为胃与心包的传变邪热在肺卫不解，由卫入气，则顺传于胃，多呈阳明热炽的病理表现：壮热、汗出、口渴、苔黄燥、脉洪大等。此即“辛凉三剂”方证在风热病邪侵犯人体后由外及内、顺传逆传的传变模式和病期特征。

桑菊饮证属风热病邪侵袭肺卫，病位主要在肺，肺主气属卫，鼻气通于肺，卫气被郁，肺气失于宣畅，表现以咳嗽为主要症状。病势表现为正盛邪微，故身热不甚；病变初起津伤不甚则口微渴。银翘散证与桑菊饮证同属于卫分阶段，邪犯肺卫，以卫气闭郁为主要病机变化，病势上正邪相争故见发热。卫气闭郁，开合失常则见无汗或有汗不畅；头为诸阳之会，卫气郁阻，经气不利而见头痛；其与桑菊饮证病变同处于初期阶段津伤不甚而口渴。白虎汤证的病变部位则是病邪加重由卫分传变入气分，脏腑病变部位在胃，病势上正邪剧争、里热蒸迫而见壮热恶热，热势较前两者加重；且热盛于里迫津外泄而见大汗不已，热盛伤津则燥渴引饮，其津伤程度较前两者甚。

发热是生物体在进化上高度保守的应对感染和损伤的防御机制，可以有效地激活免疫系统来清除病原体从而维持机体免疫稳态[11]。如图11所示“辛凉三剂”方证的信号通路的异同，“辛凉三剂”方证共有NOD样受体信号通路引发炎症发生的发热机制有目共睹，其中NOD1和NOD2在参与内质网应激诱导的炎症反应中至关重要[12]。桑菊饮证与银翘散证的共有信号通路中的Toll样受体信号通路、NF-kB信号通路、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路与Jak-STAT信号通路均为免疫与炎症相关信号通路，可以通过免疫炎症反应引起机体发热。病原微生物等外致热源入侵机体后，引发机体的天然免疫系统的模式识别受体则为Toll样受体（TLRs）[13]，细胞浆 Toll/IL-1 受体（TIR）的结构域会激活TLR信号转导通路[14]，该结构域与TIR结构域包含的接头蛋白MyD88发生相互作用[15]。由Toll样受体信号通路在中游激活NF-kB信号通路和MAPK信号通路后可在下游表达出发挥促炎作用的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和发挥趋化作用的IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β等炎性细胞因子[16-18]。IL-1β能够影响适应性免疫反应和先天性免疫反应，影响T细胞的成熟和B细胞的增殖，此外还能促进炎症分子（例如一氧化氮、磷脂酶A2、环氧合酶-2和前列腺素E2）的表达[19]。TNF-α是由单核吞噬细胞产生的多肽，是急性感染性疾病的炎症过程和临床表现的重要介质[20]。同时，在接触外致热源如肽聚糖的刺激后在Toll样受体信号通路中可形成TLR1和TLR2的复合体作用于Rac1，后激活P13K-Akt信号通路，Akt可间接作用于NF-kB/Rel复合体而发生后续的反应。T细胞信号通路也可促进IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、GMCSF、TNF-α、CDK4的细胞因子的表达，B细胞信号通路可促进细胞因子参与自身的免疫。

图11 “辛凉三剂”方证主要通路机制的异同列举（以KEGG通路编号形式展示）

由上，可发现辛凉三剂方证通过多通路诱导的免疫反应引起机体发热的过程。咳嗽是由于气管、支气管黏膜或胸膜受炎症、异物、物理或化学性刺激引起，声门关闭、呼吸肌收缩，肺内压升高，然后声门张开，肺内空气喷射而出[21]。实验研究发现咳嗽与炎症因子TGF-β1的水平和α-SMA的表达有关[22-23]。桑菊验证的咳嗽表征的病理机制，是由属于体内固有免疫的模式识别受体的RIG-I样受体介导的信号通路RIG-I受体信号通路，通过一系列的信号传递，最终激活核因子NF-kB及所介导的通路所致[24-26]。

银翘散证和白虎汤证的共有通路MAPK信号通路在炎症反应中发挥重要作用，原癌基因c-JUN的末端激酶（JNK）是MAPK信号通路的另一亚类，一些促炎性因子如TNF-α、白细胞介素家族（IL1、IL6等）都可以激活JNK通路从而加剧炎症反应[27]。且通过激活白细胞介素受体，启动MAPK途径，增加TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子的表达，发生局部炎性反应，引起发热[28]。故银翘散证和白虎汤证相较桑菊饮证不具备的信号通路的诱导下热势更重。且白虎汤证独有通路中钙离子通路又发挥了独特的作用。细胞中突触特异性建立的基础则是钙信号转导对单个神经元结构与功能适应的指导[29]。钙离子在细胞内的分布具有明显的区域特征，实验研究发现血清和脑脊液中发热介质Na+/Ca2+比值的变化与发热有关，当中枢内固有Na+/Ca2+比值发生改变，即Ca2+外流时比值升高，则体温升高[30]。且Ca2+是多种细胞功能的普遍调节因子，钙离子通路的激活诱导Ca2+的释放，胞浆Ca2+的增加通过钙离子结合引起的肌钙蛋白-肌球蛋白复合体的构象变化引起收缩[31]，进而促进胃肠道平滑肌收缩使产热增加。Ca2+也是心肌细胞中兴奋-收缩耦合的核心元素[32]，增强心肌收缩、心脏作功增加。Ca2+作用于骨骼肌、胃肠道平滑肌、心肌等细胞引起产热增加时，交感神经兴奋可以增强Ca2+浓度[33]，是否可以做出Ca2+浓度的增强也可以引起交感神经的兴奋、进而促进汗腺分泌功能加强引起大汗出的假设。

综上，本研究根据“辛凉三剂”方证在风热病邪侵袭人体后由外及内并在人体内顺传的不同病期的病变机制。风热犯肺证（桑菊饮证）的咳嗽与与炎症因子TGF-β1的水平和α-SMA的表达有关。风热袭卫证（银翘散证）的发热则在共有通路基础上由MAPK信号通路加剧炎症反应至发热较前者甚。肺胃热盛证（白虎汤证）的热盛、汗出伤津则与钙离子通路与多重直接联系。目前，将生物信息学分析应用于中医药研究的技术已日臻成熟，下一步拟基于该结果开展动物实验，以大鼠温热模型为研究对象，发挥桑菊饮证、银翘散证、白虎汤证的生物学作用，进而研究三方证对呼吸系统和消化系统的影响，以期为系统生物学结果的科学准确性提供实验数据。