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九味补血口服液的胃肠道稳定性研究

2022-04-13彭富全黄若干吴禄祥韦娜林海英蓝晓东

智慧健康 2022年35期
关键词:肠液乙素胃液

彭富全,黄若干,吴禄祥,韦娜,林海英,蓝晓东

广西白云山盈康药业有限公司,广西 南宁 530002

0 引言

九味补血口服液是在经典名方基础上创新改进组方制成,处方由人参、黄芪、绞股蓝、五味子等药材组成,具有益气补血、健脾益胃的功效,对气血两虚之失眠健忘、心悸怔忡、头晕目眩、神疲乏力、短气自汗、纳呆食少等症具有良好治疗效果[1-2]。药理作用与药物在体内的代谢行为密切相关,通过体外模拟胃肠道环境试验,开展九味补血口服液有关主要成分在胃肠道环境下的稳定性研究,本实验在前期通过ACQUITY I-CLASS Plus超高效液相色谱-Xevo G2-XS四级杆飞行时间质谱(美国Waters公司)对九味补血口服液样品溶液中的主要成分进行了定性鉴定的基础上,选取其中13个已与对照品的色谱、质谱信息进行比对所确证且相应较高的化合物,采用UPLC-MS方法,通过研究九味补血口服液化学成分在胃肠道环境下的稳定性,为后续药理机制研究奠定物质基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SCIEX液质联用系统(美国Sciex),包括ExionLC AD超高效液相色谱系统,自动进样器,柱温箱,二元泵和QTRAP Triple Quad5500+质谱,Analyst软件用于数据采集和处理。MS105DU型电子天平(瑞士梅特勒);KQ-250E超声波清洗器(昆山超声);HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒);H1850台式高速离心机(湖南湘仪)。

1.2 试药

九味补血口服液(广西白云山盈康药业有限公司,批号:211222,规格:10mL/支);人参皂苷Rb1(批号:110704-202028)、黄芪甲苷(批号:110781-202118)、五味子醇甲(批号:110857-201815)等对照品均购自中国食品药品检定研究院;人参皂苷Rd(批号:5826)、橙皮苷(批号:5836)、柚皮苷(批号:10668)、甘草苷(批号:9654)、甘草酸铵(批号:10845)、橘皮素(批号:10027)、川陈皮素(批号:6082)、五味子乙素(批号:8366)、毛蕊异黄酮(批号:10659)、五味子甲素(批号:7954)等对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;胃蛋白酶(猪源,1∶10000,生产批号:C13195129)、胰蛋白酶(猪胰脏,1∶250,生产批号:C13147398)均购于上海麦克林生化科技有限公司;乙腈、甲酸为色谱纯(美国sigmaaldrich公司),水为超纯化水,其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 人工胃液的配制

依照2020年版《中国药典》配制人工胃液,取稀盐酸16.4mL,加水约800mL与胃蛋白酶10g,摇匀后,加水稀释成1000mL,即得。

2.2 人工肠液的配制

依照2020年版《中国药典》配制人工肠液,取磷酸二氢钾6.8g,加水500mL使溶解,用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰蛋白酶10g,加水适量使溶解,使两液混合后,加水稀释至1000mL,即得。

2.3 人工胃液体外温孵实验

精密量取九味补血口服液10mL加入预温孵 30min(37℃)的90mL人工胃液混合均匀,分别在37℃水浴温孵2、4h(期间不断轻微振摇)后精密量取6mL转入10mL量瓶中,加3mL 0.15mol/L氢氧化钠溶液中和,加水稀释至刻度,摇匀,于13000r/min离心10min,取上清液,经微孔滤膜过滤,取续滤液进行液质分析。

2.4 人工肠液体外温孵实验

精密量取九味补血口服液10mL加入预温孵 30min(37℃)的90mL人工肠液混合均匀,分别在37℃水浴温孵0h、2h、4h(期间不断轻微振摇)后精密量取6mL转入10mL量瓶中,立即加水稀释至刻度,摇匀,于13000r/min离心10min,取上清液,经微孔滤膜过滤,取滤液进行液质分析。

2.5 UPLC-MS条件

2.5.1 色谱条件

色谱柱为Waters HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相为0.1%甲酸(正离子模式)或水(负离子模式)(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0~5min,2%B;5~30min,2%~80%B;30~35min,80%~95%);柱温30℃;流速为0.3mL/min;进样体积为1μL。

2.5.2 质谱条件

离子化方式:电喷雾离子化(ESI+或ESI-模式);多反应离子监测(MRM),全扫描模式(m/z50~1200);离子喷雾电压:-4500V或5500V;离子源压力:15psi;气帘气压力:20psi;干燥气体和雾化气体:氮气。人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸铵、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素的检测离子对分别为m/z1107.4→765.5,m/z945.4→621.3,m/z 6 0 9.1 →3 0 1.0,m/z 5 7 9.0 →2 7 1.0,m/z 417.1→2 55.0,m/z 8 21.4 →3 51.1,m/z 8 0 7.4 →6 2 7.3,m/z 2 8 5.0 →2 7 0.0,m/z 3 7 3.0 →3 4 3.1,m/z 4 0 3.1 →3 7 3.1,m/z 4 5 5.1 →4 0 9.2,m/z 4 0 1.1 →3 0 0.0,m/z417.2→316.1。

3 结果

以人工肠液体外温孵实验0h时供试品溶液测定的化合物峰面积作为胃肠道稳定性考察的Ao,Ai分别为人工胃液、人工肠液温孵2h、4h和3h、6h后对应化合物峰面积,按以下公式计算不同时间点各成分的变化率:

Fi=(|Ai-Ao|/Ao)×100%

结果表明,药品中的13种主要成分在人工胃液体外温孵实验中有7种发生了代谢,导致其含有量变化超过30%;而药品中的13种主要成分在人工肠液体外温孵实验中只有1种含量变化超过10%,表明这些化合物在肠液中的稳定性良好,结果见表1、图1-图4所示。

图1 口服液在人工胃液不同温孵时间的TIC 图(正离子模式)(自下而上分别为:胃液0、2、4h)

表1 不同时间点人工胃液、人工肠液的温孵稳定性实验结果

4 讨论

物质基础研究一直是中药研究的难点,文献[12]探索运用电子鼻检测中药材的药性,从而解决中药药效物质难以检测、中西药理论难以相通等难题。本研究是基于UPLC-MS技术同时测定九味补血口服液中多种成分含量,通过研究九味补血口服液代表性化学成分在胃肠道环境下的稳定性,为后续进一步开展药理作用机制研究奠定药效物质基础。经方法摸索,确定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素等7种组分选取正离子模式,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸铵等6种组分选取负离子模式。

结果显示,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd含量在人工胃液中下降最显著,可能与人参皂苷在较强的酸性条件下水解产生次级苷及苷元有关[13];五味子木脂素类组分具有很强的抗自由基活性,其主要代表成分为五味子醇甲、五味子乙素,并且五味子乙素的抗自由基作用最强[14],但五味子醇甲与五味子乙素、五味子甲素在人工胃液和人工肠液中的稳定性相反,表明胃蛋白酶的存在可能使五味子乙素、五味子甲素产生较强的降解,而胰蛋白酶的存在则可能使五味子醇甲产生一定的降解;文献[15]报道川陈皮素和橘皮素的质量浓度和pH值对吸收情况无显著影响,文献[16]报道川陈皮素在大鼠体内产生较多的代谢物,推测胃蛋白酶的存在可能对这2种成分产生较强的降解作用;甘草总黄酮被发现不仅能降低胃蛋白酶活性和胃液分泌量,还可促进胃黏液分泌,从而表现出显著的抗溃疡药理活性[17],甘草酸铵的影响因素试验结果显示,高温、高湿、氧化破坏的情况下均不够稳定[18-19],说明甘草酸铵可能并非基于酸与胃蛋白酶作用,而主要是在人工胃液中逐步被氧化所致。中药的代谢研究目前大多基于单体化合物,虽然可以简单快速地阐述其在体内的代谢产物和途径,但不能真实反映中药复方制剂在多成分下的代谢情况。本研究利用UPLCMS建立了同时测定九味补血口服液13种成分的检测方法,并应用于本品在模拟胃肠道上的稳定性研究,为后续进一步的药理作用研究提供有力支持。

图2 口服液在人工胃液不同温孵时间的TIC 图(负离子模式)(自下而上分别为:胃液0、2、4h)

图3 口服液在人工肠液不同温孵时间的TIC 图(正离子模式)(自下而上分别为:肠液0、3、6h)

图4 口服液在人工肠液不同温孵时间的TIC 图(负离子模式)(自下而上分别为:肠液0、3、6h)

由于口服药物的吸收主要在小肠上皮细胞进行,胃肠道的酸碱物理环境及消化酶作用可能直接影响药物的稳定性,从而间接对药物的吸收产生较大影响。本研究模拟药品在胃肠道上的消化与吸收过程,发现一些组分在人工胃液中存在较大程度的降解或转化,因而本研究对本品的临床应用也有一定的指导意义。因人体实际消化过程还存在大量微生物的参与,故还需结合其他研究方法,以更全面地阐明药物的体内代谢过程。

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