九味补血口服液的胃肠道稳定性研究

彭富全，黄若干，吴禄祥，韦娜，林海英，蓝晓东

广西白云山盈康药业有限公司，广西 南宁 530002

0 引言

九味补血口服液是在经典名方基础上创新改进组方制成，处方由人参、黄芪、绞股蓝、五味子等药材组成，具有益气补血、健脾益胃的功效，对气血两虚之失眠健忘、心悸怔忡、头晕目眩、神疲乏力、短气自汗、纳呆食少等症具有良好治疗效果[1-2]。药理作用与药物在体内的代谢行为密切相关，通过体外模拟胃肠道环境试验，开展九味补血口服液有关主要成分在胃肠道环境下的稳定性研究，本实验在前期通过ACQUITY I-CLASS Plus超高效液相色谱-Xevo G2-XS四级杆飞行时间质谱（美国Waters公司）对九味补血口服液样品溶液中的主要成分进行了定性鉴定的基础上，选取其中13个已与对照品的色谱、质谱信息进行比对所确证且相应较高的化合物，采用UPLC-MS方法，通过研究九味补血口服液化学成分在胃肠道环境下的稳定性，为后续药理机制研究奠定物质基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SCIEX液质联用系统（美国Sciex），包括ExionLC AD超高效液相色谱系统，自动进样器，柱温箱，二元泵和QTRAP Triple Quad5500+质谱，Analyst软件用于数据采集和处理。MS105DU型电子天平（瑞士梅特勒）；KQ-250E超声波清洗器（昆山超声）；HWS-26电热恒温水浴锅（上海一恒）；H1850台式高速离心机(湖南湘仪)。

1.2 试药

九味补血口服液（广西白云山盈康药业有限公司，批号：211222，规格：10mL/支）；人参皂苷Rb1（批号：110704-202028）、黄芪甲苷（批号：110781-202118）、五味子醇甲（批号：110857-201815）等对照品均购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rd（批号：5826）、橙皮苷（批号：5836）、柚皮苷（批号：10668）、甘草苷（批号：9654）、甘草酸铵（批号：10845）、橘皮素（批号：10027）、川陈皮素（批号：6082）、五味子乙素（批号：8366）、毛蕊异黄酮（批号：10659）、五味子甲素（批号：7954）等对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；胃蛋白酶（猪源，1∶10000，生产批号：C13195129）、胰蛋白酶（猪胰脏，1∶250，生产批号：C13147398）均购于上海麦克林生化科技有限公司；乙腈、甲酸为色谱纯（美国sigmaaldrich公司），水为超纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 人工胃液的配制

依照2020年版《中国药典》配制人工胃液，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，即得。

2.2 人工肠液的配制

依照2020年版《中国药典》配制人工肠液，取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，使两液混合后，加水稀释至1000mL，即得。

2.3 人工胃液体外温孵实验

精密量取九味补血口服液10mL加入预温孵 30min（37℃）的90mL人工胃液混合均匀，分别在37℃水浴温孵2、4h（期间不断轻微振摇）后精密量取6mL转入10mL量瓶中，加3mL 0.15mol/L氢氧化钠溶液中和，加水稀释至刻度，摇匀，于13000r/min离心10min，取上清液，经微孔滤膜过滤，取续滤液进行液质分析。

2.4 人工肠液体外温孵实验

精密量取九味补血口服液10mL加入预温孵 30min（37℃）的90mL人工肠液混合均匀，分别在37℃水浴温孵0h、2h、4h（期间不断轻微振摇）后精密量取6mL转入10mL量瓶中，立即加水稀释至刻度，摇匀，于13000r/min离心10min，取上清液，经微孔滤膜过滤，取滤液进行液质分析。

2.5 UPLC-MS条件

2.5.1 色谱条件

色谱柱为Waters HSS T3（2.1mm×100mm，1.8μm），流动相为0.1%甲酸（正离子模式）或水（负离子模式）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5min，2%B；5～30min，2%～80%B；30～35min，80%～95%）；柱温30℃；流速为0.3mL/min；进样体积为1μL。

2.5.2 质谱条件

离子化方式：电喷雾离子化（ESI+或ESI-模式）；多反应离子监测(MRM)，全扫描模式（m/z50～1200）；离子喷雾电压：-4500V或5500V；离子源压力：15psi；气帘气压力：20psi；干燥气体和雾化气体：氮气。人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸铵、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素的检测离子对分别为m/z1107.4→765.5，m/z945.4→621.3，m/z 6 0 9.1 →3 0 1.0，m/z 5 7 9.0 →2 7 1.0，m/z 417.1→2 55.0，m/z 8 21.4 →3 51.1，m/z 8 0 7.4 →6 2 7.3，m/z 2 8 5.0 →2 7 0.0，m/z 3 7 3.0 →3 4 3.1，m/z 4 0 3.1 →3 7 3.1，m/z 4 5 5.1 →4 0 9.2，m/z 4 0 1.1 →3 0 0.0，m/z417.2→316.1。

3 结果

以人工肠液体外温孵实验0h时供试品溶液测定的化合物峰面积作为胃肠道稳定性考察的Ao，Ai分别为人工胃液、人工肠液温孵2h、4h和3h、6h后对应化合物峰面积，按以下公式计算不同时间点各成分的变化率：

Fi=（|Ai-Ao|/Ao)×100%

结果表明，药品中的13种主要成分在人工胃液体外温孵实验中有7种发生了代谢，导致其含有量变化超过30%；而药品中的13种主要成分在人工肠液体外温孵实验中只有1种含量变化超过10%，表明这些化合物在肠液中的稳定性良好，结果见表1、图1-图4所示。

图1 口服液在人工胃液不同温孵时间的TIC 图（正离子模式）(自下而上分别为：胃液0、2、4h)

表1 不同时间点人工胃液、人工肠液的温孵稳定性实验结果

4 讨论

物质基础研究一直是中药研究的难点，文献[12]探索运用电子鼻检测中药材的药性，从而解决中药药效物质难以检测、中西药理论难以相通等难题。本研究是基于UPLC-MS技术同时测定九味补血口服液中多种成分含量，通过研究九味补血口服液代表性化学成分在胃肠道环境下的稳定性，为后续进一步开展药理作用机制研究奠定药效物质基础。经方法摸索，确定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、橘皮素、川陈皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素等7种组分选取正离子模式，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸铵等6种组分选取负离子模式。

结果显示，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd含量在人工胃液中下降最显著，可能与人参皂苷在较强的酸性条件下水解产生次级苷及苷元有关[13]；五味子木脂素类组分具有很强的抗自由基活性，其主要代表成分为五味子醇甲、五味子乙素，并且五味子乙素的抗自由基作用最强[14]，但五味子醇甲与五味子乙素、五味子甲素在人工胃液和人工肠液中的稳定性相反，表明胃蛋白酶的存在可能使五味子乙素、五味子甲素产生较强的降解，而胰蛋白酶的存在则可能使五味子醇甲产生一定的降解；文献[15]报道川陈皮素和橘皮素的质量浓度和pH值对吸收情况无显著影响，文献[16]报道川陈皮素在大鼠体内产生较多的代谢物，推测胃蛋白酶的存在可能对这2种成分产生较强的降解作用；甘草总黄酮被发现不仅能降低胃蛋白酶活性和胃液分泌量，还可促进胃黏液分泌，从而表现出显著的抗溃疡药理活性[17]，甘草酸铵的影响因素试验结果显示，高温、高湿、氧化破坏的情况下均不够稳定[18-19]，说明甘草酸铵可能并非基于酸与胃蛋白酶作用，而主要是在人工胃液中逐步被氧化所致。中药的代谢研究目前大多基于单体化合物，虽然可以简单快速地阐述其在体内的代谢产物和途径，但不能真实反映中药复方制剂在多成分下的代谢情况。本研究利用UPLCMS建立了同时测定九味补血口服液13种成分的检测方法，并应用于本品在模拟胃肠道上的稳定性研究，为后续进一步的药理作用研究提供有力支持。

图2 口服液在人工胃液不同温孵时间的TIC 图（负离子模式）（自下而上分别为：胃液0、2、4h）

图3 口服液在人工肠液不同温孵时间的TIC 图（正离子模式）（自下而上分别为：肠液0、3、6h）

图4 口服液在人工肠液不同温孵时间的TIC 图（负离子模式）(自下而上分别为：肠液0、3、6h）

由于口服药物的吸收主要在小肠上皮细胞进行，胃肠道的酸碱物理环境及消化酶作用可能直接影响药物的稳定性，从而间接对药物的吸收产生较大影响。本研究模拟药品在胃肠道上的消化与吸收过程，发现一些组分在人工胃液中存在较大程度的降解或转化，因而本研究对本品的临床应用也有一定的指导意义。因人体实际消化过程还存在大量微生物的参与，故还需结合其他研究方法，以更全面地阐明药物的体内代谢过程。