超声辅助提取-气相分子吸收光谱法测定火腿中亚硝酸盐

刘丰奎， 汪 雨， 钱春燕， 李 杰， 姜雪成，邵 鹏， 祖文川*

(1.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.北京市理化分析测试中心，北京 100089；3.上海市计量测试技术研究院，上海 201203)

亚硝酸盐作为食品工业领域普遍允许使用的食品添加剂，常用做西式火腿、肉罐头等食品的护色剂、防腐剂[1 - 3]。亚硝酸盐是食物中毒最多的原因之一,非法添加亚硝酸盐于肉制品中会潜在危害人类健康,过量的亚硝酸盐摄入会引发人体中毒、致癌、甚至死亡[4]。因此,亚硝酸盐在食品中残留超标问题已经成为食品安全重点关注的问题之一。我国国家标准(GB2760-2014)《食品添加剂使用标准》规定，亚硝酸盐仅允许用于肉制品，并规定了其具体残留量(除西式火腿70 mg/kg、肉罐头类50 ng/kg，其他均为30 mg/kg)，且禁止亚硝酸盐用于其它食品。

目前，食品中亚硝酸盐含量检测的标准方法为基于盐酸萘乙二胺分光光度法及离子色谱法[5]。盐酸萘乙二胺分光光度法及其改进方法已经在食品亚硝酸盐含量检测中广泛应用[6 - 8]，但总体而言，该方法容易受样品颜色、浑浊度、离子等本底干扰，且检出限相对较高。此外，该方法需要手动完成，效率相对较低。离子色谱法虽然解决了试样颜色等干扰，且对亚硝酸盐具有较为灵敏的分析性能[9 - 11]，但分析速度慢，须做清洁处理，色谱柱须精心维护，并要定期更新，维护成本较高。此外，基于流动注射的食品中亚硝酸盐分析技术由于仪器的自动化有效改善了检测效率[12 - 15]，但该方法仍基于分光光度检测，无法解决基体以及反应气泡等干扰问题。基于修饰电极的电化学方法已经较好地应用于食品中亚硝酸盐含量的测定[16,17]，但该方法电极的制备以及后续维护处理相对繁琐，影响分析效率。因此，亟需发展一种快速、灵敏且维护简便的食品中亚硝酸盐的分析方法。

气相分子吸收光谱法已经应用于环境水质中亚硝酸盐含量的监测，并展现出良好的分析性能[18 - 20]。该方法通过乙醇催化亚硝酸盐与盐酸的化学反应，将试样中亚硝酸盐氮转化为NO2，然后通过测定NO2气相分子在吸光管中特定波长下的吸光值，实现亚硝酸盐氮的定量分析。该方法实现了待测目标与基体的分离，因此不受液体的浊度、色度、金属离子干扰等的影响，且分析过程简便快速。本文基于气相分子吸收光谱法测定火腿中亚硝酸盐的含量，为测定火腿中亚硝酸盐含量提供了一种高效准确的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AJ-3700气相分子吸收光谱仪(配氘灯光源，上海安杰环保科技股份有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CR22GⅢ高速冷冻离心机(日本，日立公司)。

亚硝酸盐氮标准储备溶液(GSB 04-2840-2011，1 000 mg/L)，4 ℃下密封保存。标准溶液：吸取亚硝酸盐氮标准储备溶液1.00 mL，用去离子水逐级稀释至100 mL，得浓度为10.0 mg/L的亚硝酸盐氮标准中间液；0.00 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、1.00 mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L的亚硝酸盐氮标准系列由适量标准中间液稀释制得。盐酸为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)。无水乙醇为色谱纯(Fisher)。载流液：向400 mL 3 mol/L HCl中加入80 mL无水乙醇配制得到。实验用水为去离子水。

火腿样品：市场购买。

1.2 仪器工作条件

气相分子吸收光谱仪的工作温度：20～30 ℃；环境湿度：≤85%；氘灯灯电流：50 mA；气源压力：0.2 MPa；载气流量：0.12 L/min；PMT负高压：197 V；读数方式：峰面积。

1.3 样品处理

将火腿样品粉碎确保样品均匀后，称取试样2 g(精确至0.001 g),置于具塞锥形瓶中，加去离子水100 mL,密闭。室温提取：样品于室温提取30 min,每5 min振摇一次，保证样品均匀分散，而后将提取液转移至100 mL 离心管中，于8 000 r/min离心15 min。静置5 min，转移上清液，备用。水浴热提取：样品于60 ℃ 水浴中热浸提30 min,每5 min振摇一次，保证样品均匀分散，而后冷却至室温，将提取液转移至100 mL 离心管中，于8 000 r/min离心15 min。静置5 min，转移上清液，备用。超声辅助提取：将样品置于具塞锥形瓶中，加去离子水100 mL，迅速摇匀后，于60 ℃水浴中超声波辅助提取30 min，每5 min振荡1次，保证样品均匀分散，静置冷却至室温，将提取液转移至100 mL 离心管中，于8 000 r/min离心15 min。静置5 min，转移上清液，备用。

2 结果与讨论

2.1 亚硝酸盐测试光源及波长

在波长195～240 nm紫外区进行不同波长下亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物(NO2)的吸光度测试。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物的紫外吸收光谱。结果如图1所示，在 210～220 nm波长范围内，亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物具有较强的连续吸收。根据标准(HJ/T 197-2005)《水中亚硝酸盐氮气相分子吸收光谱的测定》，采用Zn灯作为光源，以Zn灯的特征谱线213.9 nm作为亚硝酸盐氮氧化物的吸收谱线，存在干扰较少。因此，本法选取213.9 nm作为亚硝酸盐氮氧化物的测试波长。

图1 亚硝酸盐气相分子紫外吸收光谱

2.2 提取方法

选同一火腿样品，称取3份，分别采用室温提取、水浴热提取和超声辅助提取3种提取手段，按照实方法分别提取30 min，然后分别对提取液中亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物(NO2)吸光值进行测定，结果如图2所示。结果表明，温度是影响亚硝酸盐提取效率的重要条件，60 ℃下较之室温提取能够实现更好的提取效率，而采用超声辅助提取在保证较好提取效率的同时，样品中亚硝酸盐提取效率精密度更好。

图2 不同提取方法对火腿中亚硝酸盐提取效率的影响

2.3 提取温度

选取同一火腿样品，分别在 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴下超声提取30 min。参照样品制备步骤提取样品中的亚硝酸盐，采用气相分子吸收光谱法测定亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物(NO2)的吸光值，结果如图3所示。结果表明，当采用60 ℃以上水浴进行超声提取，可以实现最佳的提取效率。

图3 温度对火腿中亚硝酸盐超声辅助提取效率的影响

2.4 提取时间

选取同种火腿样品，在60 ℃超声水浴中分别提取10 min、20 min、25 min、30 min、35 min。参照样品制备步骤，提取样品中的亚硝酸盐，采用气相分子吸收光谱法测定亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物(NO2)的吸光值，结果如图4所示。结果表明，当提取30 min以上时，可以实现最佳的提取效率。

图4 提取时间对火腿中亚硝酸盐超声辅助提取效率的影响

2.5 分析性能

在优化气相分子吸收光谱测试条件下，对标准系列亚硝酸盐氮氧化物气相分子产物(NO2)的吸收光谱进行测试，以吸光值为纵坐标，亚硝酸盐氮浓度为横坐标，拟合得到亚硝酸盐(以NO2-N计)的工作曲线，其线性方程为：A=0.2058c+0.0014，线性相关系数r=0.9999；连续测定空白溶液11次的吸光值，计算标准偏差，当取样量为2 g，采用100 mL水提取时，根据3倍空白标准偏差对应的浓度值计算得出亚硝酸盐测定的检出限为44.0 μg/kg(以NO2-N计)，根据10倍空白标准偏差对应的浓度值计算得亚硝酸盐测定的定量限为146.5 μg/kg(以NO2-N计)。对0.2 mg/L的亚硝酸盐氮标准溶液进行6次平行测试，随进样时间采集的气相分子吸收动态曲线如图5所示，相对标准偏差为0.7%。选取同一火腿样品5份，平行测定，计算测定值的相对标准偏差(RSD)考察方法精密度。样品测定亚硝酸盐含量平均值为4.78 mg/kg(以NO2-N计)，RSD为3.1%。

图5 亚硝酸盐标准溶液随进样时间采集的气相分子吸收动态曲线(n=6)

2.6 回收率

按实验方法，对北京市购得的火腿样品进行分析，并以其中某一火腿样品为代表，采用不同浓度梯度、五平行的加标回收手段来验证本方法的准确性。测试结果如表1所示，亚硝酸盐的回收率在87.7 %～111.6%之间，平均回收率范围为 96.7 %～106.4%。表明本方法测定真实样品中亚硝酸盐含量，结果准确、可靠，满足实际火腿样品的分析要求。

表1 火腿中亚硝酸盐含量测定加标回收结果(n=5)

3 结论

通过化学反应将亚硝酸盐氮转化为在紫外区有较强吸收的氮氧化物气相分子(NO2)，通过测定含氮气相分子在213.9 nm波长下的吸收，实现了亚硝酸盐的分析；而通过超声辅助的提取方式，火腿样品中亚硝酸盐能够充分、快速提取。本方法将二者结合，建立了超声辅助提取-气相分子吸收光谱法测定火腿中亚硝酸盐含量的新方法。由于该方法实现了待测物与试液基体的分离，因此分析干扰较少，分析结果准确度高，同时兼具高效、简便等优点。实际样品分析和加标回收率结果表明，本方法适用于火腿类实际样品中亚硝酸盐含量的测定，可以满足火腿加工过程中的质量控制，以及食品检验实验室火腿类样品中亚硝酸盐含量日常检测的需求。