瓜蒌提取物抗氧化药效成分群的筛选与验证

超氧阴离子自由基（O·）是O的活性代谢产物，与癌症、代谢失调、消化系统疾病等多种疾病有关。氧自由基可影响细胞膜的流动性和通透性，破坏膜上酶和受体功能，是应激性胃溃疡的重要致病因子并发挥重要作用，抗氧剂可减轻氧自由基对胃粘膜的损害。天然黄酮类化合物有着众多的生理活性，其中减少自由基的形成和清除自由基是其重要生理活性之一。中药总黄酮提取物可改善机体内多余自由基所造成的损伤，对胃溃疡有重要的保护作用。

瓜蒌为葫芦科植物栝楼（Maxim.）或双边栝楼（Harms）的干燥成熟果实，其种子和果皮分别作为瓜蒌子和瓜蒌皮入药。现代药理学研究表明，瓜蒌提取物具有抗胃溃疡的作用，而瓜蒌提取物中的黄酮类物质可能是瓜蒌提取物抗胃溃疡的活性成分。关于瓜蒌的抗氧化性，目前多限于瓜蒌多糖、多酚、瓜蒌子油及脂肪酸等成分或瓜蒌的不同提取溶剂的抗氧化性研究，未见关于瓜蒌总黄酮抗氧化特别是关于其抗氧化物质基础和药效成分群筛选的研究报道。课题组前期制备了瓜蒌总黄酮提取物并拟进一步制备成胃内速释微丸用于胃溃疡的治疗。鉴于总黄酮抗氧化性与胃溃疡之间重要的联系，有必要探究瓜蒌提取物发挥抗氧化的物质基础。为此，本研究建立了瓜蒌提取物的HPLC指纹图谱，测定了瓜蒌提取物对DPPH·、O·清除率，采用均值化邓氏关联度计算法研究瓜蒌提取物抗氧化的谱效关系并进行抗氧化药效成分群的筛选、验证分析，为瓜蒌提取物抗氧化的物质基础及药效成分群的深入研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验仪器

岛津LC-20A 高效液相色谱仪（含LC-20AT 四元泵、CTO-10AS 柱温箱、SPD-M20A 检测器）（日本岛津公司）；AUW-220D 型电子天平（日本岛津公司）；Heidolph-LR4010/4011旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司）；pHS-3C型pH计（上海越平科学仪器有限公司）。

目前很多国家对星载可展开天线机构进行了研究。其中，ETS-VIII卫星天线[1-2]是日本航空设计的两个平面桁架系可展开机构，于2006年12月26日发射成功。如图1所示，天线由14个直径4.8 m模块组成，展开口径为19.2 m×16.7 m，收拢高度和直径为4 m×1 m，每个模块由6个完全相同的肋组成。

1.2 实验试剂

瓜蒌提取物（批号：smx20211001、smx20211002、smx20211003、smx20211004、smx20211005、smx20211006、smx20211007、smx20211008、smx20211009、smx20211010，皖南医学院药物制剂及质量控制课题组）；DPPH（批号：201210075，成都格雷西亚化学技术有限公司）；芦丁（批号：141208）、异槲皮苷（批号：140404）、山奈酚（批号：150929）均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98.0%；木犀草素（批号：MO2-140513）、芹菜素（批号：QO2-140512）均购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，纯度≥98.0%；其余试剂为分析纯；纯化水（自制）。

1.3 溶液的配制

1.3.1 DPPH溶液配制 取1.3 mg的DPPH，精密称定，置于100 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，得0.13 mg/L的DPPH贮备液，备用。

水利施工现场由于具备显著的复杂性，因此亟待对此予以综合性的施工管理。通过推行现场施工监管的举措，应当能在根源上消除某些潜在隐患或者其他施工风险，确保水利建筑物应有的安全性并且杜绝某些额外的水利建设成本耗费。由此可见，施工现场管理举措应当能够渗透在全过程的水利施工中，其中包含了如下的施工现场管理关键技术：

取“1.6”项下高、中、低浓度（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）的样品溶液，参考文献［24］，分别各取样品溶液1 mL于试管中，向其中依次加入2 mL 50 mmoL/L pH=8.2的Tris-HCl溶液缓冲液，混匀，于25 ℃恒温水浴中保温20 min后，取出立刻加入25 mmoL/L 邻苯三酚溶液0.2 mL，迅速摇匀后于25 ℃恒温水浴中反应5 min，加入10 mmoL/L的稀盐酸0.3 mL，终止反应，于325 nm 处测定吸光度值A；以1 mL70%乙醇代替样品溶液，重复以上操作测定吸光度值A；同样，以去0.2 mL去离子水代替25 mmoL/L 邻苯三酚溶液，测得各组的吸光度值，记为A。按式（2）计算各样品对O·的清除率。

按“1.6”、“1.7”项下方法进行处理，测得10批瓜蒌提取物对DPPH·、O·清除率，结果见表2。

1.3.4 0.1 moL/L三氯化铝溶液 取三氯化铝1.3335 g，精密称定，用5 mL蒸馏水将其溶解，再用无水乙醇定容至100 mL量瓶中，即得。

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色谱柱：YMC-Pack ODS（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），0～25 min：15%A～22%A，25～50 min：22%A～24%A，50～100 min：24%A～24%A；检测波长：360 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10µL。

1.3.6 瓜蒌提取物的制备 参照课题组前期提取工艺，取瓜蒌（瓜蒌皮：瓜蒌子=2∶3），在40 ℃烘箱中烘干，精密称定，按照料液比1∶10（g/mL），加入70%乙醇溶液，常温下浸泡30 min，置于超声清洗机（功率200 W，超声频率40 Hz）于40 ℃超声提取3次，每次60 min，合并滤液，4 ℃下静置12 h，过滤，取滤液；用旋转蒸发仪减压回收溶剂得浸膏，用蒸馏水将浸膏转移至冷冻干燥瓶中，冷冻干燥48 h，得瓜蒌提取物（共制备10批）。

1.3.7 瓜蒌提取物样品溶液（抗氧化性测定用）取瓜蒌提取物冻干粉2.700 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，即得27 mg/mL的瓜蒌提取物样品储备液。

如果pts1,pts2,,ptsc为一组最底层并行工序任务串，其中任一并行工序任务串ptsb(1≤b≤c)可表示为ptsb={pthi,pth(i+1),,pthu}，pthi,pth(i+1),,pthu为ptsb中包含的工序任务，则ptsb的工时

第一，军民融合知识产权转移转化机制的建立是一项系统工程，必须整体设计、全面打造，确保科学有效。机制建立涉及国家、企业、当地政府，要素上连着技术、资金、知识产权、互联网生态，必须精心设计，全面打造。要坚持政府引导，争取设立专项基金、引导基金等方式，促进知识产权转移转化；坚持纵横联动，充分发挥中央与地方、行业上下、军民之间的联动，在资源配置、任务部署等方面形成合力；坚持机制创新，围绕技术、专利、人才、资本等要素，设置知识产权转移转化机制研究相关子课题，分工协作和深入研究，形成系列机制创新成果。

1.强责任意识，促青年普法服务平台建设。公开选拔优秀年轻干部，组建起“国土讲师团”队伍，深入镇、村（社区）等基层一线开展宣讲，主动帮助基层干部群众增强对国土法律法规政策及业务知识的了解和掌握。自组建以来，“国土讲师团”已赴龙山、掌起、宗汉、胜山、附海等地开展专题宣讲，参加人数高达520人次，深受基层镇村干部和群众的欢迎。

1.3.8 瓜蒌提取物样品溶液（HPLC指纹图谱测定用）取瓜蒌提取物冻干粉5.00 g，精密称定，用20 mL蒸馏水溶解，等量乙酸乙酯超声萃取3次，20 min/次，合并乙酸乙酯层并回收溶剂，残渣用甲醇定容至5 mL。

1.4 瓜蒌提取物HPLC指纹图谱的色谱条件

1.3.5 混合对照品溶液的制备 取山奈酚10.5 mg、异槲皮苷10.6 mg、木犀草素10.4 mg、芦丁10.4 mg、芹菜素10.4 mg，精密称定，分别置于50 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，制得对照品储备液。精密量取各储备液1 mL，置10 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.5 指纹图谱的建立

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本）建立瓜蒌提取物的HPLC指纹图谱并进行共有峰匹配。

1.6 DPPH·清除能力的测定

2.3.1 关联度 根据10批瓜蒌提取物指纹图谱色谱峰的峰面积均一化值和10批瓜蒌提取物对DPPH·、O·清除率测定结果，参照文献［19,25］，采用Matlab 2014a语言自编均值化邓氏关联度计算法程序，计算瓜蒌提取物指纹图谱36个共有峰与DPPH·、O·清除率的关联度（图3）。

1.7 O2-·清除能力的测定

1.3.2 Tris-HCl溶液（50 mmoL/L）取0.606 g的三羟甲基氨基甲烷，精密称定，置于100 mL 小烧杯中，加入80 mL去离子水，充分搅拌混匀溶解，用10 mmoL/L稀盐酸调节pH=8.2，最后将溶液定容至100 mL，室温保存，即得50 mmoL/LTris-HCl溶液。

2 结果

2.1 瓜蒌提取物的HPLC指纹图谱

按照“1.4”项下瓜蒌提取物HPLC指纹图谱的色谱条件，建立瓜蒌提取物的HPLC指纹图谱及混合对照品的色谱图（图1）。其中5号峰为芦丁，8号峰为异槲皮苷，31号峰为木犀草素，35号峰为芹菜素，36号峰为山奈酚。选择1号样品（S1）为参照样品，经Mark峰匹配，获得36个共有色谱峰（以下简称共有峰），并对36个共有峰的峰面积采用均值化法处理（图2、表1）。

2.2 DPPH·、O2-·清除率测定的结果分析

1.3.3 邻苯三酚溶液（25 mmoL/L）取0.1575 g邻苯三酚，精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，加入去离子水溶解并定容，即得25 mmoL/L邻苯三酚溶液。

2.3 瓜蒌提取物抗氧化的谱效关系及药效成分群的确认

取各批号瓜蒌提取物，分别按“1.3.7”项下瓜蒌提取物样品溶液（抗氧化性测定用）制备成高、中、低浓度（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）的样品溶液。参考文献［21-23］，分别各取样品溶液1 mL于试管中，再分别加入3 mL DPPH贮备液，摇匀，室温下避光放置30 min，以70%乙醇为参比，在517 nm处测定吸光度值，记为A；以1 mL 70%乙醇代替样品溶液，重复以上操作测定吸光度值，记为A；同样，以3 mL 70%乙醇代替DPPH溶液，测得各组的吸光度值，记为A。按式（1）计算各样品对DPPH·的清除率。

对于中药材需求的加剧造成中药材野生资源大量消耗，并导致生态平衡遭到破坏，药用珍惜濒危物种持续增加[42]。目前，多数中药材资源逐渐进行由野生到家种的转变，以人工栽培资源代替野生资源。但由于中药材具道地性，各地栽培黄芩种质、生态因子、田间管理差异，易造成市售黄芩质量不一，降低黄芩有效药材比例，影响黄芩进一步扩大市场。构建黄芩“无公害栽培体系”，自选择优良黄芩种质开始，结合最适生态因子筛选、田间管理及病虫害综合防治，旨在为中药材市场提供无农药、重金属及有害元素等多种对人体有毒物质的残留量均在限定的范围以内的黄芩资源。

2.3.2 关联序 根据瓜蒌提取物36 个共有峰及其对DPPH·、O·清除率间关联度，将36个共有峰按关联度由大到小排序，组成关联序，并依次标注关联序号（按关联度大小的排序）。瓜蒌提取物溶液（27 mg/mL、9 mg/mL和3 mg/mL）对DPPH·、O·清除率关联序号前18位的共有峰均依次为：21、36、8、31、14、5、27、2、24、15、18、33、22、34、35、19、28、25号色谱峰。

2.3.3 抗氧化物质基础的认定 以瓜蒌提取物（3 mg/mL）对DPPH·的关联度不低于0.9705（关联度的中位数值）以及对O·的关联度不低于0.8089（关联度的中位数值）计，均为关联序号位于前18位的色谱峰符合要求。为此，认定21、36、8、31、14、5、27、2、24、15、18、33、22、34、35、19、28、25号色谱峰对应的化学成分（简称18成分）为瓜蒌提取物抗氧化的主要物质基础。

2.4 抗氧化药效成分群对DPPH·、O2-·清除率的测定

2.4.1 抗氧化药效成分群的筛选 36号峰（山奈酚）、8号峰（异槲皮苷）、31号峰（木犀草素）、5号峰（芦丁）、35号峰（芹菜素）为瓜蒌提取物抗氧化主要物质基础中的重要已知成分，关联序号分别为2、3、4、6、15，在36个色谱峰中与抗氧化性的关联强度较高。为此，选取以上5种已知成分为瓜蒌提取物的抗氧化药效成分群（即抗氧化药效成分群，简称山奈酚等）。取山奈酚等5种成分的单体化合物，按瓜蒌提取物中各单体化合物的比例及瓜蒌提取物中总黄酮的含量制备山奈酚等混合对照品溶液并进行DPPH·、O·清除率测定，以验证抗氧化药效成分群抗氧化的效果

今年，由他研发的APP经过一段时间推行后，使用软件的焊工、技术员比不使用的每天可节约1.5小时。大家看到软件带来的好处后，开始慢慢接受新的理念和管理方式。项目部分阶段取消了纸质版焊材领用卡。很快，两个软件在十建项目现场全面使用，并取得了很好的效果。今年3月份，十建组织各项目部来创新观摩，并将该项目部定为创新基地。

2.4.2 抗氧化药效成分群溶液的制备及浓度的确定 课题组前期采用高效液相色谱法对瓜蒌提取物的化学指纹图谱及芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷和山奈酚5种混合对照品进行了分析，研究结果表明瓜蒌提取物中山奈酚：异槲皮苷∶木犀草素∶芦丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（质量比）。同时采用紫外-可见分光光度法建立了瓜蒌提取物总黄酮的含量测定方法。

取芦丁10.5 mg、木犀草素10.4 mg、芹菜素10.4 mg、异槲皮苷10.6 mg、山奈酚10.5 mg，精密称定，分别置于50 mL 量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，制得浓度 分别为0.21 mg/mL、0.208 mg/mL、0.208 mg/mL、0.212 mg/mL、0.21 mg/mL的芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚对照品储备液；按山奈酚∶异槲皮苷∶木犀草素∶芦丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（质量比），分别精密量取芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚对照品储备液适量至10 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，制得浓度为36.21µg/mL的混合对照品溶液（每mL含芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚对照品的质量合计为36.21µg）。根据瓜蒌提取物的浓度（27 mg/mL、9 mg/mL、3 mg/mL）及其总黄酮的含量（6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL），将混合对照品溶液依次稀释成6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL作为抗氧化药效成分群。

2.4.3 抗氧化药效成分群对DPPH·、O·清除率测定结果 取“2.4.2”项下混合对照品高、中、低浓度（6.12 μg/mL、2.04 μg/mL、0.68 μg/mL）溶液，参照“1.6”、“1.7”项下方法分别测定抗氧化药效成分群对DPPH·、O·清除率（表3）。

计算高、中、低浓度的抗氧化药效成分群与其相应浓度的瓜蒌提取物对DPPH·、O·的清除率的比值（Q/Q）（表4）。

由表4可知，高、中、低浓度的抗氧化药效成分群与其相应浓度的瓜蒌提取物对DPPH·的清除率的比值（Q/Q）分别为71.5%、71.5%、69.7%，说明抗氧化药效成分群与瓜蒌提取物对DPPH·的清除率基本相当，抗氧化药效成分群可较好反映瓜蒌提取物对DPPH·的清除率。高、中、低浓度的抗氧化药效成分群与其相应浓度的瓜蒌提取物对O·的清除率的比值（Q/Q）分别为13.0%、20.1%、42.6%，该比值受瓜蒌提取物浓度影响较大，随着瓜蒌提取物浓度降低，比值显著增大，抗氧化药效成分群与瓜蒌提取物对O·的清除率逐渐接近。

3 讨论

黄酮类化合物具有保护胃粘膜、抗实验性胃溃疡等作用。现代药理学研究表明，瓜蒌提取物具有抗胃溃疡的作用，而瓜蒌提取物中的黄酮类物质可能是瓜蒌提取物抗胃溃疡的活性成分。药物的抗氧化性是其发挥抗胃溃疡的重要途径之一。

研究发现，瓜蒌提取物浓度为27、9、3 mg/mL 时，对DPPH·的清除率分别为（91.5±0.36）%、（89.5±0.28）%和（87.5±0.35）%，有一定的量效关系；对O·清除率分别为（99.0±0.18）%、（48.8±1.45）%和（19.5±1.51）%，有明显的量效关系。相同浓度的瓜蒌提取物对DPPH·和O·清除率的量效关系并不一致，原因可能为黄酮类化合物清除自由基的能力与每种化合物自身结构密切相关，如B环的羟基化程度，特别是B环含邻位酚羟基黄酮类化合物可与自由基反应形成共轭半醌式自由基并中断游离自由基的链式反应，所以具有较强的抗氧化性；而糖苷基团较大的化合物如芦丁，由于受空间位阻的影响，可能会屏蔽或阻碍B环3、4-OH，使其对DPPH·清除率降低；而糖苷对清除O·有贡献，其作用大小因糖苷的种类而异。因而不同的黄酮类化合物可能对不同体系呈现出不同的抗氧化作用，也对不同类型的自由基存在选择性作用。

通过对瓜蒌提取物指纹图谱与DPPH·和O·关联度的分析，可知瓜蒌提取物中不同成分对抗氧化性的贡献程度不同。同时发现抗氧化药效成分群可较好反映瓜蒌提取物对DPPH·的清除率，但与瓜蒌提取物对O·清除率的测定结果相差较大，原因可能为瓜蒌提取物中其它成分与山奈酚等对O·清除率产生了协同作用。结合瓜蒌提取物高、中、低浓度对O·清除率的量效关系明显，分析可能起协同作用的物质含量较低，因此在瓜蒌提取物高浓度时，对O·清除率较高，随着瓜蒌提取物浓度的降低，起协同作用的物质含量快速降低，协同作用也迅速减弱，对O·清除率也快速降低，因此呈现瓜蒌提取物对O·清除率随溶液浓度降低而快速下降的实验结果。而抗氧化药效成分群中，因为没有协同物质的存在，导致其对O·清除率较低，但对O·清除率随抗氧化药效成分群浓度降低下降较为缓慢。

综合分析，筛选山奈酚∶异槲皮苷∶木犀草素∶芦丁∶芹菜素=3∶2∶2∶1∶1（质量比）作为瓜蒌提取物的抗氧化药效成分群。但应强调的是：药效成分群对某些类型自由基抗氧化作用的充分发挥需要有其它成分的协同作用，这也体现了中药是以多成分协调发挥作用的特点。在重视并完善抗氧化药效成分群研究的基础上，有待进一步对起协同抗氧化作用的物质进行深入研究。