床旁联合检测ROS和FH在鉴别良恶性胸腹水样本中的临床价值

郭 睿,赵世平,张 娜,杨 军

(西安交通大学第二附属医院病理科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:yangjundr@163.com)

胸腹水是恶性肿瘤进展、复发的常见体征之一,也是判定肿瘤分期和是否进展的重要参数。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常规细胞病理学检查实际的阳性检出率并不高,细胞蜡块技术又耗时耗力。从而导致肿瘤患者难以得到及时诊断和治疗。因此,探索新的床旁诊断技术(point-of-care-testing,POCT)实现对胸腹水的快速检测具有重要的临床意义[1,2]。

肿瘤细胞异常活跃的有氧糖酵解(也称Warburg效应)、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)和高代谢状态及由此造成的活性氧(reactive oxygen species, ROS)和细胞游离亚铁原卟啉(cell free ferrous protoporphyrin, FH)的异常聚集不仅是恶性肿瘤细胞典型的代谢特征,也直接参与恶性肿瘤的发生与发展[3-9]。因而,联合检测肿瘤细胞或组织中的ROS和FH的含量,即可实现对恶性肿瘤细胞的早期诊断。目前,ROS+FH联合检测已被用于多种恶性肿瘤的早期筛查和诊断[10-12]。但是,并未见将ROS和FH联合检测用于胸腹水样本诊断的报道。本研究拟通过对胸腹水样本中ROS和FH进行检测,评估床旁检测ROS+FH在鉴别良恶性胸腹水样本中的临床价值和意义。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集西安交通大学第二附属医院病理科2021年1月2021年10月胸腹水样本196例,其中,临床诊断恶性肿瘤患者(包括初次确诊和治疗后复发患者)样本108例(其中肺癌患者71例,其他恶性肿瘤患者37例),非恶性肿瘤患者样本88例(其中炎症患者62例,其他原因患者26例)。所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

上皮细胞ROS+FH染色试剂盒由深圳海柔思生物医学科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 细胞蜡块制备 所有胸腹水样本在制作传统细胞涂片(conventional cytological smear, CS)的同时,均制备成细胞蜡块(cell block,CB),并经石蜡切片、HE染色后,由有资质的病理医师阅片进行细胞病理学诊断,判定胸腹水的良恶性。必要时,依据HE镜下形态选择合适抗体进行免疫组化染色进行辅助诊断。

1.3.2 细胞学诊断 所有胸腹水样本的诊断标本均经常规细胞涂片、HE染色和细胞蜡块、石蜡切片HE染色后,由具有资质的病理医师进行初步诊断。并根据不同样本石蜡蜡块的HE切片中细胞的镜下形态,选择适宜的抗体进行免疫组化染色。再由具有资质的病理医师进行复诊,确定最终病理诊断。发现恶性肿瘤细胞者归为恶性组,未见恶性肿瘤细胞者归为良性组。

1.3.3 ROS+FH染色 取离心富集的胸腹水细胞混悬液1 ml置于细胞保存液中,严格按照ROS+FH染色试剂盒的操作步骤说明进行。3 min内,ROS试剂管反应后呈红色、红紫色或紫色判读为阳性(+),FH试剂管反应后呈蓝色、墨绿色、绿色判读为阳性(+),ROS和FH均为阳性者判读为阳性(+)。均阳性显示该样本瓦博格效应阳性,预示该样本存在恶性风险;均阴性显示该样本瓦博格效应阴性,预示尚无恶性风险。

1.4 统计学分析

采用列联表、Fisher精确概率法及SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,两组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞病理学诊断结果

经细胞蜡块和常规细胞涂片细胞病理学检查发现,在196例胸腹水样本中,检出恶性肿瘤细胞者67例(记为恶性),未检出恶性肿瘤细胞者129例(记为良性)。

2.2 ROS和FH联合染色结果

ROS和FH联合染色发现在196例胸腹水样本中,ROS阳性者82例,FH阳性者171例,ROS+FH双阳性者82例(见表1)。其中,以ROS、FH和ROS+FH鉴别诊断胸腹水良恶性的阴性预测值却分别高达71.05%,72.00%,69.57%(见表2)。

表1 ROS和FH联合检测鉴别良恶性胸腹水结果 (例)

表2 采用床旁检测ROS和FH鉴别良恶性胸腹水的临床价值 (%)

3 讨论

胸腹水是进展期恶性肿瘤最常见体征之一,也是判断临床分期和病情进展的重要参数。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常规细胞病理学检查流程繁琐、耗时耗力,实际的阳性检出率并不高,常因肿瘤细胞数量有限而漏诊或无法诊断,而且,还必须由具有资质的病理医生才能诊断;虽然细胞蜡块技术能显著提高胸腹水样本确诊率,但制作流程更复杂、耗时更长,而且,也同样必须要由具有资质的病理医生才能诊断[13,14];细胞DNA定量技术则须依赖特殊试剂、专用设备和分析软件[15]。因此,探索能实现对胸腹水样本快速检测和定性诊断的床旁诊断(point-of-care-testing,POCT)新方法具有重要的临床意义。

活性氧是一组含有氧自由基的高活性化学物质的统称,是细胞生物氧化还原过程中自然产生的正常产物。研究发现,癌基因突变、抑癌基因失活、转录因子活化、线粒体损伤、非特异性的慢性炎症、肿瘤细胞的高代谢状态及放化疗和生物免疫治疗等等因素均可直接或间接引起肿瘤细胞内ROS的聚集,并由此导致肿瘤细胞氧化还原态的失衡,而处于一个强氧化应激、低抗氧化的状态。而且,ROS常以浓度依赖性方式引起不同程度的DNA、蛋白质、脂质过氧化和损伤,从而发挥双重生物学效应[16]:急性高浓度ROS可直接导致细胞凋亡和坏死;中浓度ROS可引起细胞周期暂时性或永久性阻滞,诱导细胞分化;慢性低浓度ROS则可造成非致死性蛋白质、线粒体和细胞膜损伤功能异常,诱导核DNA(nDNA)交联及碱基突变或单/双链断裂和线粒体DNA(mt-DNA)突变、基因组不稳定性,促进细胞分裂、增殖及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT),而参与肿瘤发生发展及侵袭转移[17,18]。

异常活跃的有氧糖酵解和磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)是恶性肿瘤细胞葡萄糖代谢的主要方式,也是与肿瘤细胞内高ROS引起的氧化还原失衡相伴随的另一种典型的代谢特征[19-21]。有氧糖酵解产生的葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)可作为PPP途径底物,在葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)的作用下生成5-磷酸核糖和NADPH[22,23]。而NADPH则可直接参与细胞内氧化还原稳态的维持,将氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH),而谷胱甘肽过氧化物酶则以GSH为供氢体,分解H2O2减低ROS浓度,并生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)[24]。而这一过程造成的肿瘤细胞的低氧环境可引起低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)的磷酸化,并通过活性氧族(ROS)激活下游激酶系统,产生一种亲脂性分子(hydrophilic fatty molecules,HF),HF进入血红素结合蛋白(HP蛋白)的疏水核内,改变蛋白质α链CD3His和β链CD3Ser、E10Lys的极性,使位于疏水核中的亚铁原卟啉脱落,成为细胞游离亚铁原卟啉[25]。

由此可见,ROS和FH含量增高不仅是肿瘤发生的极早期代谢事件,也是恶性肿瘤典型的代谢特征,且FH含量与恶性肿瘤细胞的异常糖代谢间存在因果性关系。同时,ROS和FH含量只与肿瘤细胞的高代谢状态相关,而与肿瘤的组织学类型无关。因而,ROS和FH可作为恶性肿瘤特异的广谱代谢性分子标志物,检测细胞内ROS+FH的含量,即可判断细胞代谢功能状态,从而实现对恶性肿瘤的筛查、极早期诊断、随访及病情监测[26,27]。

由于ROS和FH具有较高的反应活性,可与相应的化学试剂反应生成有色物质而进行定性或定量检测。其中,比色法具有成本低、操作简便、无需复杂仪器设备,数分钟内采用肉眼观察反应液颜色即可判定结果,且对判读人员无资质要求,具有典型的床旁检测(POCT)技术特征。尤其适用于恶性肿瘤的床旁检测和筛查。目前,ROS+FH联合检测已被用于子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、鼻咽癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的普查、极早期诊断、随访及病程监测,并显示出明显的临床价值。

该研究通过在196例胸腹水样本评估ROS和FH联合检测在胸腹水定性诊断中的价值。结果发现,以ROS为鉴别胸腹水良恶性的诊断指标的敏感性、特异性、阳性预测值和准确率分别50.75%,62.79%,41.46%和58.67%;以FH为鉴别胸腹水良恶性的诊断指标的敏感性、特异性、阳性预测值和准确率分别89.55%,13.95%,35.09%和39.80%;以ROS+FH联合检测为鉴别胸腹水良恶性的诊断指标的敏感性、特异性、阳性预测值和准确率分别为89.55%,12.40%,34.68%和38.78%(见表2)。由此可见,分别以ROS、FH和ROS+FH联合为鉴别胸腹水良恶性的诊断指标的敏感性、特异性、准确率并不尽如人意。显然,这与ROS和FH的产生不仅与癌细胞特异性代谢有关,也与感染、炎症等因素密切相关。因而,ROS+FH联合染色并不能用于胸腹水样本良恶性的有效诊断。

尽管如此,该研究结果还显示,ROS、FH和ROS+FH作为诊断指标的阴性预测值却分别高达71.05%,72.00%,69.57%。这说明,ROS和FH联合染色虽不能用于胸腹水样本良恶性的有效诊断,但仍可凭借其较高的阴性预测值而用于排除胸腹水的恶性风险。

而且,相较于传统细胞病理学检查、细胞蜡块和细胞DNA定量等技术,ROS和FH联合检测依赖其显著的床旁检测特征,可有效用于胸腹水样本的排阴性筛查,从而快速实现对胸腹水患者的分层管理。ROS+FH阳性样本具有恶性风险,应进一步制作细胞蜡块以明确胸腹水的性质;ROS+FH阴性样本恶性风险不大,可免于制作细胞蜡块等复杂的细胞病理学检查。从而有效节约患者费用和医疗资源。

总之,尽管ROS+FH染色并不能用于诊断胸腹水的良恶性,但可有效用于胸腹水样本的排阴性筛查,从而快速排除良性肿瘤患者样本,实现对胸腹水患者的分层管理,有效节约患者费用和医疗资源。