低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂通过下调糖酵解途径抑制A549/DTPs的形成

刘 哲,温玉婷,王 旖,程文佳,惠 婵

(西安市第九医院病理科,西安 710054;*通讯作者,E-mail:wenyuting0722@126.com)

药物耐受肿瘤持留细胞(drug-tolerant persister cells, DTPs)被认为是肿瘤耐药的原因之一[1-3],探讨DTPs的抑制机制和研发新药是近年来研究热点。有研究提出,脂质过氧化酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抑制剂诱导DTPs铁死亡,防止小鼠肿瘤复发[4]。此外,糖酵解抑制剂(2-Deoxy-D-arabino-hexose, 2-DG)能够有效清除索拉非尼诱导的肝癌DTPs[5]和吉非替尼诱导的肺腺癌DTPs[6]的形成。但因这些抑制剂的毒副作用,目前尚未应用于临床。因此,找到低毒且能杀灭肿瘤细胞的药物成分靶向铁代谢或糖酵解来抑制DTPs的形成,可能对于预防肿瘤耐药和阻止复发至关重要。

近年来国内学者发现,传统的天然药物成分或其有效成分能作用于肿瘤细胞的重要靶点,影响肿瘤细胞的能量代谢,发挥低毒高效杀伤肿瘤细胞的作用[7]。丹参酮ⅡA是唇形科植物丹参的主要有效成分之一,具有抗肿瘤的细胞毒作用,能够通过下调糖酵解关键酶丙酮酸激酶的同工酶(PKM2)抑制慢性髓性白血病细胞[8]、食管癌细胞[9]的增殖。但低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂能否抑制DTPs的形成尚不清楚。

本研究通过顺铂诱导药物耐受人肺腺癌A549持留细胞(A549/DTPs)模型,探讨低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂能否减少A549/DTPs形成,即抑制DTPs形成,并分析与糖酵解途径的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物

人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物研究所。顺铂诱导的A549/DTPs模型为本实验室自建。

1.2 试剂与引物设计

1.2.1 试剂 GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2、β-actin抗体购自美国Abcam公司(货号:ab33780、ab213721、ab119796、ab8555、ab8226);CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司;兔抗人辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;RNAiso Plus试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自Takara公司;丹参酮ⅡA、顺铂、ATP检测试剂盒购自Solarbio公司;乳酸测定试剂盒购自Eton Bioscience公司。

1.2.2 引物设计 内参基因选择β-actin。所有目的基因引物均根据pubmed提供的GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2核酸序列,利用软件Primer-BLAST设计,引物全部由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物序列

1.3 细胞培养

1.3.1 人肺腺癌细胞株A549的培养 A549细胞采用F-12K培养液,添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素,于37 ℃、5%CO2加湿培养箱中培养,选择对数期细胞进行实验。

1.3.2 顺铂诱导的A549/DTPs的构建 参照文献[1]方法构建持留模型。将A549细胞用4 μg/ml(IC50)顺铂处理10 d,每3 d更换培养基后,重新加入4 μg/ml顺铂;PBS清洗后,在无顺铂的培养液中培养40 d后,再用4 μg/ml顺铂处理10 d。培养条件同1.3.1。

1.4 A549/DTPs对顺铂耐受的检测

使用不同浓度的顺铂(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10 μg/ml)分别处理A549、A549/DTPs 24 h。采用CCK-8法检测细胞抑制率。

1.5 低毒剂量丹参酮ⅡA、顺铂以及两药联用浓度的选择

参考文献[10]方法筛选低毒剂量丹参酮ⅡA、顺铂以及两药联用浓度。使用不同浓度的丹参酮ⅡA(0,1,5,10,20,50,100 μg/ml)处理A549/DTPs 24 h。采用CCK-8法筛选细胞抑制率约在10%(IC10)时剂量作为丹参酮ⅡA的低毒剂量。使用低毒剂量丹参酮ⅡA与不同浓度顺铂(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10 μg/ml)混匀后处理A549/DTPs 24 h。采用CCK-8法检测细胞抑制率,筛选与低毒剂量丹参酮ⅡA联合时顺铂的终浓度。

1.6 联合用药协同作用Isobologram分析

根据CCK-8实验结果,得到顺铂、丹参酮ⅡA对A549/DTPs的IC50,分别设为a、b,标于纵坐标轴和横坐标轴上,分别连接a、b两点的直线。根据CCK-8实验结果,求得联用低毒剂量丹参酮ⅡA时,顺铂的IC50,分别设为X、Y,若c(X,Y)点在ab连线上,则表示两药联用为相加作用;在该连线以下,表示两药联用为协同作用;在该连线以上,表示两药联用为拮抗作用[10]。

1.7 细胞分组及处理

为探究低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂对A549/DTPs的影响,以及与糖酵解途径的相关性,将A549/DTPs分为4组:①对照组给予PBS处理A549/DTPs 24 h;②顺铂组给予终浓度为0.1 μg/ml顺铂处理A549/DTPs 24 h;③低毒剂量丹参酮ⅡA组给予终浓度为20 μg/ml丹参酮ⅡA处理A549/DTPs 24 h;④低毒联合组给予终浓度为20 μg/ml丹参酮ⅡA联合0.1 μg/ml顺铂混匀后处理A549/DTPs 24 h。采用CCK-8法检测细胞抑制率,ATP含量检测试剂盒检测ATP含量,Western blot检测GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2蛋白表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2 mRNA表达。

在水库除险加固二期工程建设时，由于自筹资金不到位，原设计的溢洪道安装橡胶坝项目并没有实施。水库设计兴利库容为2 409万m3，但由于未安装橡胶坝，最高蓄水位只能到溢洪道底板高程937 m，达不到正常蓄水位942 m，达不到兴利库容标准。从2008年除险加固工程完工至今，能基本保证城市供水；由于农田灌溉大部分还在使用机电井，对库水需求量未达到设计需水量，所以暂且可以维持。随着地下水位逐渐下降，地表水需求量的加大，水库现有兴利用库容将不能满足要求。

1.8 CCK-8法检测细胞抑制率

将A549/DTPs按照5×104细胞/孔接种于96孔板,取100 μl接种于96孔培养板,按照1.7所述实验分组进行细胞处理,每组设5个复孔,每孔加入CCK-8试剂10 μl,37 ℃孵育继续培养2 h。酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度(optical density, OD)值,并计算细胞的抑制率(inhibition rate, IR),IR(%)=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100%。实验至少重复3次。

1.9 ATP含量检测试剂盒检测ATP含量

收集A549/DTPs调整至5×106细胞/ml,按照1.7所述实验分组进行细胞处理,取1 ml至离心管内,1 000g,4 ℃离心3 min,弃上清,加入提取液1 ml,超声波破碎1 min(冰浴,强度20%,超声2 s,停1 s),10 000g,4 ℃离心10 min;取上清液至另一个EP管中,加入500 μl的氯仿充分震荡混匀,10 000g,4 ℃离心3 min,取上清,置冰上待测。紫外分光光度计预热30 min以上,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。测定方法严格按照ATP检测试剂盒说明书进行。

1.10 qRT-PCR法测定GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2 mRNA表达情况

1.11 Western blot法检测GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2蛋白表达情况

将A549/DTPs以5×105细胞/孔接种于6孔板待细胞贴壁后,按照1.7所述实验分组进行细胞处理,用预冷的PBS洗2遍,每孔加入含有1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液120 μl,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集上清液蛋白,BCA试剂盒定量各组蛋白浓度。使用10%～12%的SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,转膜,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,一抗GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2(工作液浓度1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育1 h。化学发光法显影,运用全自动化学发光图像分析系统对蛋白条带进行分析,检测蛋白表达情况。

1.12 统计学处理方法

2 结果

2.1 构建顺铂诱导的A549/DTPs

A549细胞用4 μg/ml的顺铂处理10 d后,约5%～8%的A549细胞进入静止(持留)状态;随后,将A549/DTPs在无顺铂完全培养基中培养40 d后,A549/DTPs重新恢复生长;加入4 μg/ml顺铂,约20%细胞再次进入静止(持留)状态(见图1)。

2.2 A549/DTPs、A549细胞对顺铂的耐受情况

CCK-8结果显示:当顺铂浓度≥0.5 μg/ml时,与A549细胞比较,A549/DTPs的细胞抑制率降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。顺铂对A549细胞、A549/DTPs的IC50分别为4.05 μg/ml和16.68 μg/ml。

2.3 低毒剂量丹参酮ⅡA与顺铂的联合用药浓度的筛选

CCK-8结果显示:丹参酮ⅡA对A549/DTPs的IC50是104.73 μg/ml。当丹参酮ⅡA浓度≤20 μg/ml时,作用于A549/DTPs 24 h后,细胞抑制率在10%以下。故选择20 μg/ml(IC10)低毒剂量丹参酮ⅡA进行后续实验。CCK-8结果显示:与单用顺铂比较,当顺铂浓度≥0.1 μg/ml时,顺铂联合低毒剂量丹参酮ⅡA后细胞抑制率升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。联用20 μg/ml低毒剂量丹参酮ⅡA后,顺铂的IC50为4.32 μg/ml。故选择0.1 μg/ml顺铂联合20 μg/ml丹参酮ⅡA进行后续实验研究。

与A549细胞比较，*P<0.05图2 顺铂对A549、A549/DTPs的细胞抑制率的影响Figure 2 Effect of cisplatin on cell inhibition rate of A549 and A549/DTPs

与顺铂组比较，*P<0.05图3 丹参酮ⅡA及其联合顺铂对A549/DTPs的细胞抑制率影响Figure 3 Effect of tanshinone ⅡA and its combination with cisplatin on cell inhibition rate of A549/DTPs

2.4 联合用药协同作用Isobologram分析

Isobologram分析发现,低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂作用A549/DTPs的IC50坐标c(20,4.32)落在a(16.68,0)和b(0,104.73)连线左下方(见图4),提示低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂对A549/DTPs有协同作用。

图4 Isobologram分析低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂对A549/DTPs的协同作用Figure 4 Synergistic effect of low toxic dose of tanshinone ⅡA combined with cisplatin on A549/DTPs by Isobologram analysis

2.5 联合用药对A549/DTPs的细胞抑制率的影响

CCK-8法结果显示,与低毒联合组相比,顺铂组和低毒剂量丹参酮ⅡA组细胞抑制率较低,差异具有统计学意义(P<0.05,见图5)。

2.6 联合用药对A549/DTPs ATP含量的影响

与对照组相比,顺铂组和低毒剂量丹参酮ⅡA组ATP含量差异无统计学意义(P>0.05),低毒联合组ATP含量降低(P<0.05,见图6)。与顺铂组和低毒剂量丹参酮ⅡA组相比,低毒联合组ATP含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见图6)。

2.7 联合用药对A549/DTPs中GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2 mRNA和蛋白表达的影响

与对照组相比,顺铂组和低毒剂量丹参酮ⅡA组GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2的mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),低毒联合组GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2的mRNA和蛋白水平均下调(P<0.05,见图7)。与低毒联合组相比,顺铂组、低毒剂量丹参酮ⅡA组GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2的mRNA和蛋白水平均上调,差异具有统计学意义(P<0.05,见图7)。

3 讨论

肺癌是全球发病率最高、死亡率位居第3的恶性肿瘤,也是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[11]。其中,非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌发病率的85%。在晚期NSCLC治疗中,以顺铂为基础联合新化疗药作为标准一线化疗方案。但顺铂因不可避免的毒副作用,限制了其使用剂量,导致化疗效率低且形成耐药,最终造成肿瘤局部复发和远处转移[12]。因此,提高顺铂化疗效率、减少耐药对晚期肺癌的治疗具有重要的临床意义。

顺铂耐药机制很多种,大多数学者认为是基因进化的结果。然而与耐药不同,在2010年,Sharma等[1]研究证实,逃避肿瘤治疗可能不需要新的基因突变。文中提出,在抗肿瘤药物的暴露下,大部分肿瘤细胞被杀死,但仍有一小部分肿瘤细胞亚群存活下来,药物压力下会进入“persister state”(持留状态),由此逃避药物作用。但当药物压力去除后,恢复细胞增殖和对药物的敏感性,呈现出可逆的药物耐受状态,这些采用动态生存策略的肿瘤细胞小亚群称之为“药物耐受持留细胞”(drug-tolerant persister cells,DTPs)。这种现象类似于细菌对抗生素产生的持留状态[13]。随后越来越多的学者关注到这一现象,更有学者提出,DTPs可能是耐药肿瘤细胞的“储备池”[3]。有效抑制DTPs形成被认为是减少传统化疗和靶向治疗耐药,预防肿瘤复发的有效手段之一[3,4]。在本研究中成功构建了A549/DTPs,使用IC50剂量的顺铂冲击A549细胞10 d,观察到绝大多数细胞被迅速消灭,但约有5%～8%的细胞始终存活。在解除顺铂压力后,这部分细胞继续生长。当使用等剂量的顺铂再次冲击,约20%细胞再次进入静止(持留)状态。并通过CCK-8法验证了A549/DTPs对顺铂产生了耐受。这与DTPs的相关报道一致[3]。

Hangauer等[4]提出,DTPs的形成与上皮-间质转化(EMT)之间存在很强的联系,其中包括DTPs细胞形态改变和细胞外基质成分的增加、侵袭性以及对细胞凋亡的抵抗。并且发现处于间充质状态的DTPs依赖于GPX4生存,通过抑制GPX4,提高细胞质中活性氧类(reactive oxygen species, ROS)水平,最终诱导DTPs铁死亡,防止小鼠肿瘤复发。随后研究人员发现,糖酵解抑制剂2-DG能够有效清除索拉非尼诱导的肝癌DTPs[5]和吉非替尼诱导的肺腺癌DTPs的形成[6]。虽然这些研究表明靶向铁代谢或糖酵解都是一种很有前景的抑制DTPs形成策略,但这些抑制剂对机体的毒副作用无法预知,仍在实验阶段,未能应用于临床治疗。因此,找到低毒且能杀灭肿瘤细胞的药物成分靶向铁代谢或糖酵解来抑制DTPs的形成,可能对于预防肿瘤耐药和阻止复发至关重要。

近年来许多研究发现,传统的天然药物成分或其有效成分能够影响肿瘤细胞的能量代谢,并产生抗增殖和杀伤肿瘤细胞的作用[14]。其中,唇形科植物丹参传统应用于祛瘀止痛、活血通经、凉血消痈,丹参酮ⅡA是丹参的主要有效成分之一,具有抗肿瘤的细胞毒作用[7]。大量文献表明,丹参酮ⅡA能够抑制血液和实体肿瘤,包括白血病[8,15]、非小细胞肺癌[16]、食管癌[9]、结直肠癌[17]和肝癌[18]、宫颈癌[19]。但丹参酮ⅡA能否抑制DTPs的形成目前尚不清楚。为了探究低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂能否抑制A549/DTPs形成,本研究通过CCK-8法筛选低毒剂量丹参酮ⅡA、低毒剂量丹参酮ⅡA和顺铂联用剂量,并通过Isobologram分析发现联合用药具有协同作用,采用CCK-8法检测联合用药对A549/DTPs的细胞抑制率的影响,发现低毒剂量丹参酮ⅡA和顺铂联合用药能够抑制A549/DTPs的增殖。这一结果意味着低毒剂量丹参酮ⅡA减少DTPs的形成,可能成为一个预防顺铂耐药有前途的策略,但与糖酵解途径的关系需要进一步探究。

肿瘤细胞即使在氧供充足的情况下,通常也表现出较高的糖酵解水平,并依赖糖酵解途径生成ATP,促进肿瘤生长增殖、侵袭转移,这也被称作“Warburg”效应[20]。而糖酵解关键酶(GLUT4、HK2、PFKFP3和PKM2等)表达水平的提高是糖酵解水平增强的主要原因,与肿瘤的增殖、迁移和侵袭有关,并与肿瘤放疗抵抗、化疗耐药密切相关[21-23]。更有研究表明,丹参酮ⅡA可通过参与调控糖酵解途径抑制肿瘤细胞增殖。丹参酮ⅡA能够参与介导PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制糖酵解途径导致宫颈癌细胞凋亡[19]。丹参酮ⅡA也通过下调糖酵解关键酶丙酮酸激酶的同工酶(PKM2)抑制慢性髓性白血病细胞[8]、食管癌细胞[9]的增殖。为了探究低毒剂量丹参酮ⅡA联合顺铂抑制DTPs的形成,与糖酵解途径有无相关性,本研究采用ATP含量试剂盒检测联合用药对A549/DTPs ATP含量的影响,qRT-PCR法及Western blot法检测联合用药对A549/DTPs GLUT4、HK2、PFKFP3、PKM2 mRNA和蛋白表达的影响。结果发现两药联合能够减少A549/DTPs ATP含量,下调糖酵解关键酶的表达,说明联合用药抑制A549/DTPs的形成,可能与糖酵解途径有关。但联合用药能否影响糖酵解途径潜在的分子机制还有待进一步研究。

综合上述结果提示,低毒剂量的丹参酮ⅡA联合顺铂抑制A549/DTPs形成,即抑制顺铂诱导的DTPs形成,与糖酵解途径有关。本研究为有效抑制DTPs形成,预防顺铂耐药提供新的治疗策略。